转帖 做苏丹红的经历

一开始也是抓瞎，并没有怎么关注，后来真的要做了，才开始盲人瞎马。说真的，做苏丹红的标准呢，那叫一个爽，瞎做都非常好，想用甲醇用甲醇，想用乙腈用乙腈，不嫌麻烦想加点酸也可以，偷点懒不想加酸也无所谓。要求不高的话，做梯度最好，懒点做等度也可。但是做样品那就是做恶梦，一开始同事用乙腈直接溶提出来的红油，出来的谱图跟火烧云一样的壮观，密密麻麻高低错落全是峰，做得对不对就看运气了。我们有同事想了一个办法，就是在阳性的情况下改变流动相，如果还是阳性就认为它是阳性，个人认为这个办法不是说不好，但报阳性的结果还是太危险，而且用乙腈来泡样品，至少要稀释10倍，大大降低了灵敏度。不过在当时的情况下也是个不是办法的办法。

    某日偶们做到一个阳性样品，制备液的浓度大约1点几个ug/ml，不放心，领导说要找一个液质的平台来确证。本来偶有一个平台可以用，但刚巧老板出差了，联系不上，偶也不敢擅自动用，只好找一个别的单位。这个平台是API2000，做应该是没有问题的，可是这位老兄做LC/MS有一个特殊的习惯，他不用酸，所以他的流动相里也不加酸，偶虽然知道不对，但由于是在别人的地盘上，也只能客由主便了。由于当时流行的欧盟方法的版本中苏丹红1号的质量数有错误，偶跟同事发生了分岐，偶认为只要看到分子离子峰就可以了，他坚持还要看1000多的那个离子，他们的解释是可能发生聚合，我倒啊！那位老师调来调去总是另外一个200多的峰是基峰，还一再问我们分子量是否错了，因为他认为那个基峰就是苏丹红1号，后来我指出他的那个基峰在所有的地方都出现而并非只在PDA上出峰的那个地方出现，而且，从他刚才跟我们聊天的过程中偶然知道，他最近帮别人做过的一个药“刚好”分子量就是那基峰，他才放弃了认为那个峰就是苏丹红的想法。就这样进了无数针，折腾了一整天，终于得到了一个信噪比大约是2的选择离子流图的峰（1.Xug/ml的浓度啊，同志！），算是完成了确认。

   后来出国标了，媒体说得神秘无比，先进无比，曰用了一个星期日夜兼程找到了某种特殊的吸附材料可以把苏丹红完全吸附而去掉其它色素。下下来一看，不禁哑然失笑，原来是用氧化铝啊，我们查到的第一篇文献就是用氧化铝来净化样品测苏丹红一号，而且是用分光光度计，再翻翻偶的通用化学手册，在薄层色谱那一章，赫然就写着用苏丹红一号来评价层析用氧化铝的活性。注意，这本书是1987年出版，评价氧化铝的活性的这个方法专门有一个名称，是以发明这个方法的人命名的。国标方法是否独创新颖且不谈，那是宣传的问题，只要好用就好。

   经常用氧化铝的人都知道，氧化铝这玩意是便宜，但不同的厂家，甚至不同批次的氧化铝，它的活性是相差比较大的（要不然为何对它的活性评价方法都还要专门命名呢？），而且它的活性还是随含水量的变化而变化的。标准方法上所写的制备程序，只不过给了使用的人一个参考而已，如果你真要如此这般煮啊洗啊烤啊，最后再加2%的水陈化24小时，最后得到的氧化稆的活性跟起草人得到的一致的可能性其实远小于5%。做出来了你还得用回收率来评价你的氧化铝的活性，用标准过柱子的时候还要看着回收率低是因为保留太强还是保留太弱，再来通过调整含水量来调整氧化铝的活性以达到适当洗脱体积洗脱苏丹红的目的。也就是说，制备氧化铝一次成功的机率远小于5%，我们假定你经验丰富，两次成功，至少48小时，也就是两天的时间过去了。活性调整好了，可以恭喜你了吗？还没完，我想你不会愿意象蝉那样在地底下做4年的苦工，也就唱一个星期的歌吧，辛苦做好的的氧化铝你当然希望可以用到它被用完还跟当初刚出炉时一样。可是氧化铝的含水量随时间变化是肯定的，多长时间变化到不可再用？标准没有回答你，我也不能，所以很抱歉，你下次做的时候还要对它进行评价，如果它的活性已经变化到不可接受，你还得重新调整或者干脆重新制备。偶的一个同事做肾上腺素用氧化铝处理样品就是这样，现在她都快要崩溃了。当然，也有很多人很无畏，说“我不管，反正它是国标，我照着它做就是了，错不错是国标的事”，从某种角度来说，也成。

    国标的流动相部分不谈了，偶觉得跟巫婆神汉嘴里念念有词时念的那玩意一样，看起来复杂神秘，其实只是唬人的，啥也不是。检出限，按国标的那个做法，用紫外检测器也不可能达到10ug/kg，更何况PDA了（除非是AGILENT的PDA真的有那么好，谁知道呢，胖版可能知道，偶没用过，不知道），要知道，国标说的可是定容到5ml。实际上，按国标的做法，也只能定容到5ml，定容体积小了，杂峰一样的不可接受。

    国标靠不住，只有自力更生。由于目标物是脂溶性的，偶想到了用GPC，虽然偶没有自动GPC，但手动的是现成的，BIO-BEADS的填料已经泡好了长期备用。花了两个小时灌了一根33cm的柱子（为什么一定是33cm?当然不一定是这么长，只是因为偶的柱子是2*50cm的，偶随手灌的就是这么高了），做了流出体积曲线，做了加标回收，净化效果出奇的好，走出来的图干净得象假的。用2ml的辣椒油加标上样，最后用0.5ml溶剂溶解残渣，做出来的图也仍然很干净，如果想提高灵敏度，用更小体积来溶样也还是可以的，我想。偶没有专门的时间和人手来做研究，只是拉了一个同事帮帮忙，忙里偷闲地也做了差不多一周，虽然做得很粗糙，但本人认为比国标要好得多，只是填料比氧化铝要贵很多。如果按5克样到0.5ml计，3N的检出限大概是3-6ug/kg，当然，如果非要说辣椒油只能取2克，那么检出限就没那么低了，我承认，但我还是认为辣椒油也许不需要那么低的检出限。

    最近几天鸡蛋鸭蛋的又闹起来了，领导又让做，偶依言做了8个鸡蛋8个鸭蛋，只有一个做出疑似。虽然胖哥很热情，但是太远了，而且这次运气很好，老板在家，偶一打电话他就同意了，让偶可以实现亲自在液质平台上做苏丹红的梦想。虽然偶做那台LC/MS也做了2年多了，偶还是出乎意料地进了4针标准才确定了一个比较好的方法。主要的原因在于按偶在液相上做的方法，苏丹红3号和4号出峰的位置乙腈（加了酸的）的比例是100%，好象在这个条件下它们的电离不理想，5ug/ml的标准也只出很小的峰，1号和2号还是巨大无匹。后来只好把最终的乙腈比例降到95%，虽然灵敏度只提高了5倍，但噪音却小了很多，可以做了。如此这般地折腾，5点多钟开始，8点多钟才做完，好在样品是阴性，要不然还要做2级，可能还要晚。
昨天晚上由于只是完成任务，而且毕竟也不是我们单位的仪器，所以不便深入地做下去，不知道3号和4号的灵敏度低是不是真的是因为100%乙腈的原因？或者是酸加得不够还是用甲醇加酸会好一点？希望有更多大侠指点。