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维生素B2(核黄素)的测定——荧光法（二）
关键词：食品安全检测 农药标准物质 无机标准样品 进口标准物质维生素B2(核黄素)的测定——荧光法（二）
4．测定步骤
①样品提取
a．水解：称取2～10g样品(约含10~200µg核黄素)于100 m L锥形瓶中，加入50 mL0．1 mol·L -1盐酸，搅拌至颗粒物分散均匀。用40 mL瓷坩埚为盖扣住瓶口，置于高压锅内高压水解30min。冷后，滴加1mol·L -1氢氧化钠，边加边摇动，加至pH=4．5为止(取少许水解液，用溴甲酚绿检验呈草绿色)。
b．酶解：对于含有淀粉的水解液如谷物样品，加入3 mLl0％淀粉酶溶液，于37~40℃保温16 h；对于含高蛋白的水解液，加人3 mL 10％木瓜蛋白酶溶液，于37~40℃保温16 h。
c．上述酶解液用水定容至100．0 m L，用干滤纸过滤。此滤液在4℃冰箱中可保存一周。
②氧化去杂质：根据样品中核黄素的含量，取一定体积的样品提取液及核黄素标准使用液(约含1～10µg核黄素)，分别置于20 m L的具塞刻度试管中，加水至15 mL。各管加0．5 mL冰乙酸，混匀。加3％高锰酸钾溶液0．5 mL(如滤液中含杂质多，可适当增加数量)，混匀，放置3 min，以氧化滤液中的杂质。再滴加3％过氧化氢溶液数滴(除去多余的高锰酸钾)，直至高锰酸钾的颜色褪掉。剧烈振摇试管，逸出多余氧气(如果高锰酸钾过量，出现二氧化锰微粒沉淀，应离心除去)。
③核黄素的吸附和洗脱：称硅镁吸附剂1 g，用湿法装入柱内(占柱长5 cm左右)，然后将已经氧化的样液全部通过吸附柱，用约20 m L热水洗去杂质。用5．00 m L洗脱液洗脱核黄素并收集于一带盖lO m L刻度试管中，再用水洗吸附柱，收集洗液并定容至lO mL，混匀。核黄素标准使用液同样按以上方法进行纯化处理。
5．荧光测定
于激发波长440 nm、发射波长525 nm，测量样品管及标准管的荧光值。然后在各管的剩余液(约5～7 mL)中加0．1 mL 20％低亚硫酸钠溶液，立即混匀，在20 s内测出各管的荧光值，作为样品空白值和标准空白值。
6．计算
X= (cV/m)*[(U-UB)/(S-SB)]*(V1/V2)*(100/1000)
式中：X——样品中核黄素的含量，mg·(100 g) -1；
U——样品管荧光值；
U0——样品管空白荧光值；
S——标准管荧光值；
SB——标准管空白荧光值；
c——核黄素标准使用液浓度，µg·m L；
V——用于氧化去杂质操作的核黄素标准使用液体积，m L；
V1——用于氧化去杂质操作的试样提取液体积，mL；
V2——样品水解酶解后定容总体积，mL；
m——样品质量，g。
7．说明
①本法适用于粮食、蔬菜、调料、饮料等脂肪含量少的样品，脂肪含量过高及含有较多不易除去色素的样品不适用。
②核黄素对光敏感，整个操作应尽可能在暗室中进行。
③氧化去杂质，加人高锰酸钾的量不易过多，以避免加人双氧水的量大，产生气泡，影响核黄酸的吸附及洗脱。
④核黄素可被低亚硫酸钠还原成无荧光型；但摇动后很快就被空气氧化成有荧光物质，所以要立即测定。
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