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【求助】居然出现这样的WESTERN结果？我晕了

字体: 小 中 大 | 打印 发表于: 2015-4-06 15:55    作者: fklo83    来源: 分析测试百科网

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【求助】居然出现这样的WESTERN结果？我晕了
各位高人：
    我最近在做WESTERN ,做的是tPA,做了有一个月了，但是结果是各种奇怪，我也是通过各种方法去验证，去改正，但是又出了这样的结果，我直接崩溃。首先我的大概流程是这样的。
    1，TPA的分子量为63KD，我选用10%的分离胶，5%的浓缩胶，浓缩胶恒压70V, 分离胶是100V.
       2，湿转，恒压，110V,1H 40mins。转膜后的胶和NC膜我分别用考马斯亮蓝和丽春红去染色，确认转膜效率很高。
    3，用5%的脱脂牛奶封闭1H.
       4，一抗稀释比例从1:1000到1:50，前面一直不出来，没有任何条带，直到1:100和1:50，但结果很奇怪，所有蛋白全会曝出来，（结果会在后面附图，稀释液用了封闭液，也用了TBST尝试）。一抗是4度过夜孵育。
    5，二抗稀释比例是1:3000，孵育一小时，同样是用过封闭液或TBST 稀释。
    6，用ECL发光液，稀释10倍。
    7，曝光从最初的3s到后面的2h。
    现在不知道是哪里出问题了，可是前面是一直做不出来，曝光的片子上没有任何条带，但是昨天做的一抗稀释比例 1:100和1:50的结果更是诧异，现在我是没法了，请求高人指点一二，小虫我先谢过了。
    附注图片：这是一抗1:100的结果
    我的目的蛋白条带应该在上面，最亮的条带不是我的目的蛋白，这是怎么回事啊？怎么可以检测到其它蛋白呢，还比目的蛋白的条带亮？
[img]file:///C:/Documents%20and%20Settings/Administrator/Application%20Data/Tencent/Users/315841812/QQ/WinTemp/RichOle/95%`2SLKVYA`H5[H)JPENAI.jpg[/img]
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最新回复

  • qianqin1977 (2015-4-06 15:56:03)

    看不到图片呀

    你试试用DAB显色呢

    显色时间短一点

  • qianqin1977 (2015-4-06 15:56:20)

    如果你一抗浓度合适的话，那4度过夜是不是时间有点长，你试试室温摇床反应1.5小时左右。

    封闭可以室温摇床过夜封闭，第二天再加一抗。

    楼主可以试试啊

  • qianqin1977 (2015-4-06 15:56:36)

    我以前做western，一抗是杂交瘤细胞的培养上清，有的很好，有的得稀释。腹水的话，1:100,1:200吧

  • qianqin1977 (2015-4-06 15:56:58)

    在植物蛋白western-blot检测时我也遇到类似情况，最可能的还是样品中就没有目的蛋白（植物中没有，没提取出来），当然也可能有其他情况，？western-blot的灵敏度还是可信的，一抗浓度太高和曝光时间太长是不可取的

  • fklo83 (2015-4-06 15:57:28)

    上图~~~~~~~~~~~~


    C__Users_h_Documents_20120907_协议1.jpg

  • fklo83 (2015-4-06 15:57:47)

    QUOTE:

    原帖由 qianqin1977 于 2015-4-6 15:56 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
    看不到图片呀

    你试试用DAB显色呢

    显色时间短一点
    不好意思啊，图片怎么没传上去，我重新传了，现在我觉得是一抗的问题

  • fklo83 (2015-4-06 15:58:03)

    不好意思，图片之前居然没传上去，我补传了，我肯定我这个蛋白是表达的，也是提出来了，就算表达丰度低，也应该多少检测出来一点的，可现在是非特异性条带很多，这个我实在是不怎么什么原因了

  • fklo83 (2015-4-06 15:58:23)

    QUOTE:

    原帖由 qianqin1977 于 2015-4-6 15:56 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
    在植物蛋白western-blot检测时我也遇到类似情况，最可能的还是样品中就没有目的蛋白（植物中没有，没提取出来），当然也可能有其他情况，？western-blot的灵敏度还是可信的，一抗浓度太高和曝光时间太长是不可取的
    ...
    一抗浓度我是从1：1000到1：50，各个浓度都做了，之前是压根什么都没有，现在做到1：100是有条带出现了，而且暴光时间我也是从最初的3秒到最后的两小时，都尝试过，可还是不行

  • veiwu (2015-4-06 15:58:43)

    你用高浓度的一抗才出现非特异性的条带，最大的可能性就是你的蛋白浓度太低了，而目的蛋白的丰度低，所以曝光的时候特异性条带没有出现，可以尝试一下浓缩样品蛋白，或者加大上样量。

  • newway (2015-4-06 15:59:03)

    确定你这一抗特异性非常好么 我也是做了一个月 几乎都是空带 我用转膜marker证明不是转膜的问题 而且100v 1h足以转膜250kDa蛋白 最终我只能得出结论一抗不能结合细胞内目的蛋白，但是可以结合原核表达的目的蛋白

  • newway (2015-4-06 15:59:40)

    你高浓度的一抗会产生非特异性的结合片段 那样意味着抗体结合效率本身就很低 换个一抗才可取

  • fklo83 (2015-4-06 16:00:02)

    QUOTE:

    原帖由 newway 于 2015-4-6 15:59 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
    你高浓度的一抗会产生非特异性的结合片段 那样意味着抗体结合效率本身就很低 换个一抗才可取
    嘿嘿，谢啦。我们已经投诉了，我觉得是抗体的问题
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