为什么PCR结果不稳定 [转自丁香园论坛]

字体: 小中大 | 打印发表于: 2011-8-13 15:00 作者: HOT兔来源: 分析测试百科网

为什么PCR结果不稳定 [转自丁香园论坛]

第一次PCR都能P出单一的条带；第二次重新提了DNA，再P就怎么也P不出来，我也怀疑第二次的DNA是不是质量有问题，但是经过仪器检测OD值比例显示DNA含量还是很高的，而且16SrDNA也能P出来，现在就不知问题到底出在哪？请大家帮忙分析一下，谢谢。

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最新回复

HOT兔 (2011-8-13 15:00:27)

我觉的模板污染核酸酶的可能性大一点，很可能你P的就是一个低丰度的基因，恰好被降解掉了（猜的）
我之前从2号染色体上P一个500bp大小的片段P了几次都P不出来，后来换了一种提全基因组DNA的方法就OK了，模板的问题。
所以你不妨试一次，用最干净的枪头和管子还有试剂来提一次总DNA，然后用TE溶解（不必担心会对Taq酶活性产生影响，因为你PCR体系里加的量很少，一点点EDTA不足以影响到Taq酶的活性），再做一次重复。甚至你可以用RNA级的tip头和试剂，虽然浪费点。

有的实验室做DNA都不对枪头进行灭菌的，这其实是很不好的习惯。不知道你们怎么样，不过做核酸小心一点总不是坏事，对吧。
HOT兔 (2011-8-13 15:01:30)

我也觉得可能是模板的质量导致的，我用试剂盒纯化过，可以隐约P出条带，但是不明显且杂带多。对枪头和管子，我们还是比较注意的，但是就是再没出现第一次P的效果了，呵呵，第一次P咋运气那么好呢？！
HOT兔 (2011-8-13 15:01:56)

可是引物和程序都没有改变，而结果却P不出来。
HOT兔 (2011-8-13 15:02:26)

有可能引物的问题，你换引物试一试。
HOT兔 (2011-8-13 15:02:52)

还是引物的问题吗？可是我第一次都能p出很亮很单一的条带，为什么就不能再p出来了，说不通
HOT兔 (2011-8-13 15:03:08)

首先可以再用第一次的DNA去尝试一下，如果有结果，而且分子量大小与预期的结果是一致的，再去P第二次的DNA，反应条件与反应的体系不变，如果P 不出来。说明还是第二次的DNA有问题，仪器检测OD值比例显示DNA含量还是很高的，如果DNA有污染呢，一样可以出现你现有的结果，再试试吧。祝你好运
HOT兔 (2011-8-13 15:03:42)

谢谢回复。可是我第一次的DNA电泳结果显示，已经有部分降解的现象，而第二次提的DNA也有这个趋势，很奇怪我第一次发现这么容易降解的DNA，DNA都保存在－20度。
HOT兔 (2011-8-13 15:04:20)

P不出来不一定就是模板的问题，虽然你首先注意到的是换了模板。