求助：我的PCR这是怎么了？再也扩不出了[转自 丁香园论坛]

最新回复

• 花裙子 (2011-8-15 16:18:39)

  PCR就是很神奇，我的前几天也扩增的很好，有几天老是有拖尾，现在空白对照（未加DNA）也出现目的条带，考虑污染，等换体系再说！你的不行的话就换换试剂再说吧！不要着急！祝 好运！

• 花裙子 (2011-8-15 16:19:02)

  有时候加样枪和枪头不准，也有可能让你漏掉或少加了一些重要成分。还有水

• 花裙子 (2011-8-15 16:19:31)

  我正在经历这个问题。半个月前我的一个目的基因能扩增出来，但后来就扩增不出来了。以为是引物的问题，重新定了引物，但序列没变，但是仍然扩增不出来。RNA提取质量可以（实验室老师鉴证的）；cDNA浓度也很合理（紫外分光计测得）；pcr体系扩增内参和另一个目的基因都很好；就是有这个目的基因扩增不出来，换了PCR体系，没有效果。请高人指点啊。

• 花裙子 (2011-8-15 16:21:08)

  PCR原理简单，操作简单，摸体系也不难，但当它不出带的时候，却无法找到答案。
  
  主要原因：
  
  PCR扩增仪不稳定
  
  引物设计不合理
  
  模板不合要求

• 花裙子 (2011-8-15 16:22:09)

  可是我做了一次，P的很好，同样的模版第二次就没扩出来，做了四个重复，只有一个有淡淡的带， 可明明第一次做的很好啊，我实在费解，耽误我大半个月了 毫无进展啊

• 花裙子 (2011-8-15 16:22:31)

  既然PFU酶可以扩出来，那么就是酶或buffer的问题，用buffer（低温下可能会有盐离子解析出来）的时候记得混匀，如果buffer不混匀的话，越往下实验就越做不出来；
  
  用你原来的酶与buffer（都换一管新的）把实验重新做一次，如果还不行那就换酶吧，PFU酶贵的话还有别的酶或许可以扩的出来，康为世纪的Es Taq Polymerase 扩增就很不错的。

• 花裙子 (2011-8-15 16:23:10)

  还没解决，决定换一批细胞，试一试。因为各个环节逐一排查，都不存在问题。虽然细胞表达缺失的可能性很小，也得一试。

• 花裙子 (2011-8-15 16:23:31)

  还没解决，决定换一批细胞，试一试。因为各个环节逐一排查，都不存在问题。虽然细胞表达缺失的可能性很小，也得一试。

• 花裙子 (2011-8-15 16:24:10)

  其实这种问题做PCR时候非常常见，有带的时候一定要抓紧尽快完成任务。楼主可以试试下面几种办法
  
  1.最佳选择，用PFU完成实验。
  
  2.换一管TAQ试试
  
  3.变一下退火温度， 降低，提高都试试。
  
  4. 用PFU的PCR产物做模板进行第二步的PCR
  
  祝实验顺利