求助：RT-PCR法获取目的基因，怎样设计引物

最新回复

• 麻瓜 (2011-8-16 15:05:58)

  GenBank 找到目的序列，用Primer设计你要的区域
  =。

• 麻瓜 (2011-8-16 15:06:23)

  或者用别人使用过的引物,通过blast检验是否正确．

• 麻瓜 (2011-8-16 15:09:14)

  明确你的实验目的，是想进行基因克隆，还是检测表达，
  如果是进行克隆，那么就应该是扩全长，若是检测就只要扩部分片段，
  两者设计引物时，要求完全不同。
  引物设计相关精华可参考：
  cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=67&id=708662&sty=1&tpg=1&age=-1')
  －－－－－－－－－－－－－－
  你的目的似乎是想扩出目的基因，所以应该是要扩全长。
  步骤如下：
  1。在genebank中搜到目的基因的全长mRNA序列；
  2。确认目的片段的编码序列，也就是CDS；
  3。根据CDS，在ATG及终止密码前后的序列来设计最佳引物；
  －－－－－－－－－－－－－－
  以TNF为例，谈谈如何搜到目的序列：
  首先进入NCBI主页，然后在搜索框中输入“TNF”，数据库选“Gene”；

  
  1.jpg

• 麻瓜 (2011-8-16 15:10:18)

  得到搜索结果708个，第一个就是我们要的结果，点击“TNF”。

  
  2.jpg

• 麻瓜 (2011-8-16 15:10:53)

  进入TNF分子主页面。有关于TNF的详细描述及相关链接。

  
  29067960_snap.jpg

• 麻瓜 (2011-8-16 15:12:20)

  往下看，其中就有mRNA和protein的ID，点击mRNA的链接。

  
  85051791_snap.jpg

• 麻瓜 (2011-8-16 15:12:55)

  进入以下页面：

  
  29133152_snap.jpg

• 麻瓜 (2011-8-16 15:14:28)

  下拉，看其CDS序列，为170—871；
  也就是说mRNA全长1669，但编码蛋白质的序列仅仅是从170－871bp处；

  
  49201690.jpg

• 麻瓜 (2011-8-16 15:15:50)

  所以我们要扩的TNF是从170－871，
  设计引物时可以适当在ATG和TGA前后挪动，以获得最佳引物，但是余地不大。
  同时要考虑装到载体上后，密码子不能移位，以确保正确地表达出蛋白。

  
  72218608_snap.jpg

• 麻瓜 (2011-8-16 15:16:33)

  引物设计可以通过许多软件，这里就不累述了。
  祝大家都能够顺利得到目的片段。
  重复一下坛里的精华：
  引物设计相关：
  cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=67&id=708662&sty=1&tpg=1&age=-1')  

• 麻瓜 (2011-8-16 15:16:52)

  请明确你的实验目的，是想进行基因克隆，还是检测表达，
  如果是进行克隆，那么就应该是扩全长，若是检测就只要扩部分片段，
  你的目的似乎是想扩出目的基因，所以应该是要扩全长。
  步骤如下：
  1。在genebank中搜到目的基因的全长mRNA序列；
  2。确认目的片段的编码序列，也就是CDS；
  3。根据CDS，在ATG及终止密码前后的序列来设计最佳引物；
  －－－－－－－－－－－－－－
  那么所谓的全长就是指cDS了？？？而并非指整个mRNA序列？

• 麻瓜 (2011-8-16 15:17:20)

  注意：cDS是编码区(coding sequence),不是指全长.

• 麻瓜 (2011-8-16 15:17:40)

  为什么同样是这样找，有的基因找不到啊？
  大鼠的？