求助：如何选择并调整内参基因？【转自丁香园论坛】

字体: 小中大 | 打印发表于: 2011-8-19 16:25 作者: 王六六来源: 分析测试百科网

求助：如何选择并调整内参基因？【转自丁香园论坛】

做相对定量的real-time PCR遇到如下问题：

实验组和对照组内参基因(如β-actin或GAPDH) 的CT不一致

如何判断，这种不一致到底是由于初始cDNA拷贝数不一致导致的，还是由于内参基因受到处理因素影响，从而发生变化导致的？

举个例子，A组为对照组大鼠，B、C、D组为实验组大鼠

选用β-actin作为内参基因，进行预实验，A、B、C、D四个组各取3只老鼠的cDNA(同一组内3个生物学重复)，每个样本有三个复孔(3个操作平行)，计算β-actin CT值的均值，发现A、B、C、D四个组的CT值均值分别为16.2，18.2，17.5，17.8；

我是应该换一个内参基因，使其在四组间CT均值保持一致？(万一换了还是不一致呢？)

还是应该将CT低的样本的cDNA进行稀释，如将A组cDNA稀释100倍，这样理论上来说，其β-actin的Ct均值应该就增大了2；

看到园子里有高手说，可以用多个看家基因结合的方法，来进行相对定量，但具体是怎么操作的呢？

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王六六 (2011-8-19 16:37:44)

自己先顶一下，感觉这是个有价值的问题
王六六 (2011-8-19 16:38:11)

首先先要确定处理后不发生变化的内参基因。可以搞个试剂盒，如takara的，有一系列的house keeping gene的primer，先做一次实验，比较这些内参基因中，哪些是不受你的处理因素影响的。挑选合适的内参基因。

然后就是做下一步的实验了，你说是做相对定量，那么首先要做目的基因和内参基因的标准曲线，确定扩增效率是否一致，不一致的话，就考虑用双标准曲线法啦。你说你的实验组和对照组内参基因(如β-actin或GAPDH) 的CT不一致，这个很正常啊，你最后的结果是要通过将目的基因和内参基因的比值来获得的。
王六六 (2011-8-19 16:38:28)

试验组和对照组的内参基因应该是一致的吧？要不然如何用作均一化的标准呢？
王六六 (2011-8-19 16:38:46)

内参基因不是任何情况下都不变化的，也就是说不是什么内参基因都能直接拿来就用，首先要考察你想做为内参的基因到底受不受你处理因素的影响，如果没有显著变化，才能用。
王六六 (2011-8-19 16:52:55)

请问如果已经有合适的引物，下一步该怎样考察我想做为内参的基因到底受不受处理因素的影响呢？
王六六 (2011-8-19 16:53:35)

反转相同数量的RNA成cDNA,加样量相同，上机检测，比较Ct
王六六 (2011-8-19 16:54:10)

thx, fish! 那么通常需要多少样本量去检测处理前后样本的内参基因才能使结果具有统计学意义？
王六六 (2011-8-19 16:55:06)

一样的啊，做三次实验，每次三复孔。