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求助：甲基化PCR——DNA提取，C-T，PCR全过程求助

字体: 小 中 大 | 打印 发表于: 2011-8-20 14:49    作者: 大猫    来源: 分析测试百科网

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本人长期没有接触分子生物，最近要做一个基因启动子甲基化分析，需要测序。因此进行了甲基化PCR一系列实验。当然，结果是惨淡的，目的条带没有P出来。我把详细过程写出，希望群里面的高手出来帮帮忙，帮助小妹度过难关。
1.DNA提取
我使用的是天根生物的血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒。使用柱提的方法得到了DNA。使用核酸定量分析仪，得出核酸的浓度大约在100-200ng/ul。浓度还可以，但是260/280的比值在1.9-2.0.显然是有RNA污染的。跑了个胶稍微有点拖尾。由于当时手里没有RNA酶，所以就没有管RNA的问题。直接进入下一步。
2.C到T转化
没有使用传统的硫酸盐处理，而是使用了ZYMO research的EZ DNA Methylation-gold kit。使用柱子，非常方便，正如其公司的广告“the beauty of science is easy”。什么事简单就好。将最后洗柱得到的转化后DNA去定量，发现收获30-60ng/ul的转化DNA。收获率大约为60-100%。挺好~~可惜是洗脱液加入10ul最后只能得到6-7ul左右，太少，做不了几次PCR，更不适合摸PCR条件
3.PCR
直到这一步之前，都还挺爽，希望能一次出条带。我使用的是promega的RT-PCR试剂盒，是前辈留下的。我将反转录的部分去掉，留下了PCR那部分taq酶，10*buffer，dNTP，water。按照说明书提示体系（50ul），我稍微做调整变为20ul的体系。（说明一下，引物是来自国外文献，应该是没有什么问题，由生工合成，打开前离心是还见到了沉淀，应该有东西。
我的体系：
taq 酶 0.5ul
dNTP （10mM each） 0.5ul
引物 F （10mM） 1ul
引物 R （10mM） 1ul
10* buffer 2
模板 2
水 13

第一次做出来没有条带，今天又做了一个touch down。降低了Tm值到50°，仍然没有条带。请大家帮我分析一下，不甚感激！！！
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  • 大猫 (2011-8-20 14:50:40)

    看了你的帖子，有几个问题需要了解一下：
    1，你的基因组DNA来源于：血液？组织？还是细胞？如果是来源于新鲜的组织或者细胞，按照zymo kit的说明，以2ug 的量修饰完毕后，我一般都用30ul的elution buffer来收集，然后分装保存于-70度，避免反复冻融。保存几个月都没有问题的。
    2，BSP对酶的要求比较高，最好选用hotstart的酶，我以前用过takara的hotstart酶，最近也用过ABI 的amplitaqgold，都还不错。建议另外选购合适的PCR酶。
    3，你确信BSP的引物确实没问题？我建议你最好找到该基因启动子区原始序列，然后按照bisulfite modification的原则把引物和原始序列进行比对，看看有没有错误。我曾经因为课题的原因，把cancer research一篇文献中的BSP引物和原始序列进行了反复的比对，发现有一条引物链5端一个碱基不匹配，后来和通讯作者JG Herman（作甲基化的都应该知道该大牛了）进行了沟通，最后才明白这不是一个错误，而是为了避开那个CpG site同又要减少偏倚而故意增加的一个mismatch，让我受益匪浅啊。

  • 大猫 (2011-8-20 14:51:03)

    问题已经找到了。原来的taq酶已经过期。换了天根的2*PCR mixture已经做出了条带。用的touch down，没有杂带。
    国外大牛确实让人佩服，感觉他们是在玩实验，我们是被实验玩

  • 大猫 (2011-8-20 14:51:24)

    很好，希望你接下来的测序分析顺利，也期待你进一步分享成功的经验。

  • 大猫 (2011-8-20 14:51:42)

    看来都是做甲基化的老手，实验的经验十分丰富，不知道MS-HRM的甲基化检测方法有没有试过？

  • 大猫 (2011-8-20 14:51:59)

    我现在也在做MSP真是令人头疼，我用的都是天跟的DNA提取和DNA 亚硫酸盐修饰的Kit，但是就是只能批出甲基化的条带，批不出非甲基化的，更换了很多条件，还是出不来，我看很多paper，都是非甲基化的条带很容易出来。

    BSP要求酶很重要吗，如果做MSP能出来band的酶做BSP也可以吧。哪位大侠能帮小妹分析一下原因。还有个问题，如果BSP能够批出条带的话，能直接用产物送公司测序吗？

    MSP要求的实验条件很苛刻吗，我都做了半年多了也出不来我想要的结果，请大侠们给我指点一下

  • 大猫 (2011-8-20 14:52:25)

    ++++++++最近刚开始摸索 ++++++++++
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