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关于送测序所需PCR时相关问题及解决方法

字体: 小 中 大 | 打印 发表于: 2011-8-20 17:01    作者: 椰子叶子    来源: 分析测试百科网

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关于送测序所需PCR时相关问题及解决方法
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各位学长，小弟按导师要求取血DNA做pcr送部分测序，刚开始做，用的是TAQmix,可以看见目的条带，但亮度不够，再加模板的量，怎么做，就是做不出来。没辙了，请园子里高手指导，谢谢。俺是临床的，患者搞的定，但这家伙我做了一个礼拜，头大，火大，还躲着老板-等着呢。请园子里有经验的晒晒，谢谢。  

[ 本帖最后由 miracle 于 2011-9-5 15:17 编辑 ]
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  • 椰子叶子 (2011-8-20 17:01:50)

    引物效率和mix效率都不高，导致PCR产物量太少，办法很多

  • 椰子叶子 (2011-8-20 17:02:12)

    可以看见目的条带的话 要是没有非特异扩增直接切胶回收，然后连入t载体不就完了，再送t载测序就ok了

  • 椰子叶子 (2011-8-20 17:02:29)

    １，增加循环数量。

    ２。把得到的条带，割胶回收，以这个为模板，继续ＰＣＲ扩增。

    注意酶的保真性，毕竟你要测序。

  • 椰子叶子 (2011-8-20 17:02:58)

    谢谢各位，明天决定换酶，我做的上千份，头大大。要是切胶回收，那就玩完了。增加循环数效果不明显

  • 椰子叶子 (2011-8-20 17:03:21)

    我做过很多这样的实验，可保证你测序成功，如需要帮助，可加Q：1679805835

  • 椰子叶子 (2011-8-20 17:03:45)

    可找华大基因公司做，量多的30-40元每个，自己做麻烦！

  • 椰子叶子 (2011-8-20 17:04:04)

    您现在的问题是扩增的产率低，建议您可以优化反应条件：改变Tm值；增加镁离子的浓度；改变模板的浓度或者纯化模板；延长延伸时间；增加循环数；优化聚合酶的浓度。

    如果还是效率比较低的话，那么有可能是因为您的DNA是从血液中得到的，纯度可能不是很高，建议您可以采用血源扩增的DNA聚合酶试试。
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