求助：PCR有很明显的杂带？

最新回复

• 我是一片云 (2011-8-21 12:30:25)

  另外请问一般文献里面注明的gene bank accession no.是怎么得到的？

• 我是一片云 (2011-8-21 12:31:17)

  100bp处的是引物二聚体，需要提高退火温度，建议做梯度摸条件。

• 我是一片云 (2011-8-21 12:32:11)

  100bp一下是引物二聚体，出现的原因可能是1 引物设计有问题，二级结构很多。2 退火温度不适宜
  
  建议你进行一个退火温度的梯度PCR，寻找最适合的温度。如果还不行，只能重新设计引物啦
  
  预祝 实验顺利

• 我是一片云 (2011-8-21 12:33:55)

  100bp为引物2聚体，建议重新设计引物！

• 我是一片云 (2011-8-21 12:34:33)

  引物二聚体过多，可以考虑重新设计引物，或者提高退火温度。当然如果用以上的方法都不不行，可以看一看你的PCR仪是否能够在扩增的时候分时间段改变退火温度：比如前十个循环使用较低的温度，后二十个循环增加2度退火温度，这样有可能减少一些非特异扩增。

• 我是一片云 (2011-8-21 12:35:22)

  另外请问一般文献里面注明的gene bank accession no.是怎么得到的？
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  genbank登录号，是你的序列上传到genbank后，发配给你的一个序号。
  同时，貌似你跑胶用的是5000的marker？其实按照你的片段你选用DL2000的marker就足够了。

• 我是一片云 (2011-8-21 12:36:54)

  谢谢各位，我用的是1000bp的maker

• 我是一片云 (2011-8-21 12:38:22)

  第一张图上看，100bp下方的带不像引物二聚体，引物二聚体一般是一团模糊的，不会像这样边界清晰，应该是扩增出来的杂带，而且你的目的带这么弱，提高退火温度估计是行不通的。建议重新设计引物，如果实在没有好的引物的选择的话，可以考虑添加一些常用的enhancer。

• 我是一片云 (2011-8-21 12:38:51)

  你好 请教楼主一个弱弱的问题，你的maker是10000的吧 感觉跑的很亮

• 我是一片云 (2011-8-21 12:39:08)

  是1000的marker

• 我是一片云 (2011-8-21 12:39:44)

  我的引物是文献上查的，一般都是影响因子三分以上的文章，但是按以上各位意见，提高退火温度好像还是不见得改善，而且我的好几个mRNA RT-PCR后还是与第一幅图一样的结果