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RT-PCR经验浅谈
RT-PCR成败的关键首先在于RNA模板的制备RT-PCR经验浅谈
以问者的口气
应该是做RNA病毒基因的RT-PCR
本人三年前做过一个正链RNA病毒全基因组分段扩增
设计方案是将全基因组分成7个片段，0.6kb-3.3kb不等
分别进行RT-PCR扩增
刚开始的三个月
我们课题组三个人辛辛苦苦
什么招都想过了
结果连一个片段都没有拿到
后来有一个周末
我一个人安安静静做了一天
PCR跑胶的结果足以让我兴奋一个月：
一下子隐隐约约出了3个片段！！！
紧接着把胶里的弱带切下
水溶并后做二次扩增
很快，三个预期的片段都得到了理想的扩增
后来大家也可以想象
不到一个月
12kb的全基因组各片段全部收归囊下
小声地告诉各位
我这次成功的关键在于
提取RNA时，收集沉淀这一步
离心速度不要低于13000rpm（r=5cm）
提高离心速度、延长离心时间
在离心前的沉淀也尽可能在低温下长时间进行
这些时我本人总结出来的经验
在后来的实验中
几乎每次RT-PCR都非常顺利
除了
材料本身就没有目标基因
BTW:
我甚至还不知道如何用DEPC对实验用具进行繁琐的处理
可能大家还不相信吧
有需要的话
请大家re
我以后可以继续写二、三.......
[ 本帖最后由 miracle 于 2011-9-5 15:11 编辑 ]
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最新回复
格格巫 (2011-8-22 11:44:21)
ok
格格巫 (2011-8-22 11:44:43)
水溶并后做二次扩增
能不能具体说明一下
格格巫 (2011-8-22 11:45:06)
在UV下，参照marker
将特异性高，且与预期大小相同的DNA带切出
放在一个ep管里
加入适量无菌水
用枪头将胶反复搅碎
高速离心
小心吸取2ul上清用作模板
进行第二次PCR扩增
understand？
格格巫 (2011-8-22 11:45:53)
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