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大家来说说自己PCR失败的原因

字体: 小 中 大 | 打印 发表于: 2011-8-22 17:27    作者: 小鼹鼠    来源: 分析测试百科网

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大家来说说自己PCR失败的原因
影响PCR成功的因素很多，一、二个月做不出结果的很多。这期间的心情也是无比的烦躁。大家来说说PCR失败的原因，一方面总结经验启示目前革命未成功的战友，另一方面也可使他们的心情暂时得到舒缓。
我先来抛砖引玉：我在生工合成了目的基因及内参的引物。预实验跑目的基因成功，加如内参后始终没有结果。多次进行条件优化仍无结果。后借用他人的内参得到结果，原来问题出在内参的引物上。而同时合成的目的基因的引物却是好的。
再说一个我同学的奇怪遭遇：我同学跑PCR多时未有结果，后更换了一台PCR仪后得到结果，而那台PCR仪别人使用时却可以得到结果。奇怪！  
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  • 阿福 (2011-8-22 17:28:10)

    我是个新手，做PCR做了近一个月都没有出结果，也进行了多次实验条件优化，也没有出。我老师说有可能引物在合成制成干粉的时候被丢失了。她说在刚开始实验的时候她只在一个管中看到了引物干粉。我想问问各位遇到过这种情况吗。可能吗？

  • 阿福 (2011-8-22 17:28:52)

    还有啊，想去重新合成引物，去NCBI匹配这两天总是上不去。不知道各位有没有这种情况啊。

  • 天蓝蓝 (2011-8-22 17:29:21)

    合成回来的引物在溶解后，一定要测OD260定量，如果按照厂家给的量去溶解100%不成。至于干粉丢失的问题，不常见，但偶尔发生也不足为奇。

  • 天蓝蓝 (2011-8-22 17:29:21)

    合成回来的引物在溶解后，一定要测OD260定量，如果按照厂家给的量去溶解100%不成。至于干粉丢失的问题，不常见，但偶尔发生也不足为奇。

  • 花裙子 (2011-8-22 17:29:51)

    我也是个做pcr的新手，不过幸运的是有老师指导。我做了9个目的基因，有一个是循环次数的问题，要加大次数才能看到产物。一个是引物的问题，换了4次，在文献上查的，有时候前辈们的工作是要好好学习借鉴！其他还好，就是变变退火温度

  • 羊咩咩 (2011-8-22 17:30:16)

    我也做了一个多月的PCR,最终才出来结果,真是被折磨的快不行了,引物又重新让生工合成了,换了很多优化条件都不行,那种感觉只有做过这方面实验的人才能体会,不断看资料,找原因,引物和模板浓度匹配很重要.坚持一定会看到希望的曙光

  • 饭团团 (2011-8-22 17:30:45)

    我失败的原因很多，现在也是偶尔出结果。原因如下：
    pcr仪不是所有孔都能出结果。能出结果的孔要做标记，下次好再用。

    退火温度。调整了很久。

  • 快乐的大脚 (2011-8-22 17:31:17)

    我想问一下有关操作方面的原因，加量方面的影响等

  • 阿拉蕾 (2011-8-22 17:31:44)

    失败并不可怕，郁闷的是不知道败在哪里！

  • 阿拉蕾 (2011-8-22 17:32:13)

    我做PCR筛查我的试验做了半年，条件摸了不止半年年，人都快垮掉了。咱不是不出，是出得不漂亮，咱的检测一天可能是引物问题，一天可能模版问题，模版还有浓度和加入量，一天发现mix好像不太好，还有一阵是水的问题，总之那个混合液，程序，都被我折腾烂了。最后还发现后期电泳也有问题。最后来一人跟我说看来我的电泳与电压有关，说我其它我还算过关的，我等到半夜12点半，电泳一样不满意。血的教训，PCR的每一种成分都狠狠关键，很很重要。混合液试剂保存，混合的低温环境，上机程序，上机后电泳前储存，电泳的条件，想出好结果，怎么精心都不过份。
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