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只有引物二聚体没有目的条带，内参有条带
只有引物二聚体没有目的条带，换引物还是这样，内参有条带，求助原因啊！ [转自 丁香园论坛]只有引物二聚体没有目的条带，内参有条带
最近2个月反复做PCR跑电泳一直都是只有引物二聚体没有目的条带，
我的PCR条件是这样的
模板1ul （浓度100ng）
引物上下游各1ul （浓度10uM/L）
pcr mix 10ul （用过biotek的mix，也用过takara 的EX Taq HS）
rnafree水 7ul
94℃ 5min
94℃ 30s
55-60℃ 30s
72℃ 1min
72℃ 10min
目的条带从173到690不等
内参跑出来了而且很清晰，所以我觉得我的cdna模板没有问题，
一开始认为是引物问题，就又查阅了很多英文文献，把引物全都用Oligo7软件验证了，选择了最理想的几对引物，
现在很困惑，想请高手们帮我分析下原因，
自己也查阅过网上的解答，但是有些问题不明白
1.引物浓度问题，引物浓度过大会引起二聚体，但是我查阅过有些文章说引物的工作浓度20uM/L比较合适，所以我20ul体系各加1ul似乎不是很高啊，而且内参也是这个加的这个量，内参跑出来了
2.退火温度问题，退火温度我做过梯度，一样，都没有条带，只有二聚体
3.模板浓度问题，我的模板浓度是100ng，不知道是不是合适
4.Mg2+浓度问题，有不少文章提到Mg2+浓度对实验影响很大，但是我不知道如何调整，Mg2+应该是在我买的pcr mix里面吧？那减少mix的量？如果这样的话酶的量不是也少了么
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最新回复
+田田+ (2011-8-23 15:47:18)
6.有不少文献中的引物经过Oligo验证，都提示 上下游引物溶解温度差别大，所以我没有选用，我一直很困惑，很多文献的引物我验证了都不太好，为啥人家还能做出结果呢？
7.最后还有个问题就是加试剂顺序的问题，我喜欢先加水，然后加mix，然后加引物，最后加模板，这样是不是不太好，是不是应该最后加mix？
暂时这么多问题，希望大家能帮帮我，再做不出来我要崩溃了- -
补充一个问题，
8.酶效率问题，会不会是我的酶效率不好呢？预变性时间5min应该不短了吧，如果循环中的变性时间加到45s试试会不会有改善呢?
米米 (2011-8-23 15:47:54)
首先，我觉得你的引物浓度还是稍微有点高，通常我和你一样浓度的引物，50ul体系各加1ul，当然，个人感觉这不是主要的问题。
其次，楼主强调actin可以扩增出来，说明cDNA没有问题。但要考虑到你基因的丰度问题，如果是扩增低丰度或者GC含量高等比较特殊的基因，扩增不出来是很正常的，所以你的条件还需要优化，多分析一下，是否序列GC比例很高，还有，要用多种的cDNA进行扩增，扩增上可以进行touch-down PCR，以增加PCR成功的可能性，还可以加大PCR循环次数，将次数增加至35-45cycles。
Mg离子建议楼主不要去自行摸索浓度，如果基因内部GC比例合理，则选择酶所标配的buffer.
引物设计是经验性的活，通常我建议你一直用一个软件设计，我一般用pp5.0
PCR各循环的时间我觉得没太大问题，甚至我觉得有点偏长，我通常每cycle变性和退火都是15-20s，但这是个人习惯，合理范围内不影响结果。
总的来说，建议楼主多分析一下基因序列，多做几种cDNA，选择一下touch-down PCR，增加cycle数，还有酶别用太差的。
+田田+ (2011-8-23 15:48:29)
大仙 (2011-8-23 15:49:07)
如果mRNA 3末端有很稳定的二级结构，不推荐使用oligo T，用随机引物可能会更好一些；
如果使用oligo dT，引物的位置应尽可能靠近mRNA的3末端。
米米 (2011-8-23 15:49:40)
今天减少了引物的量又做了一次，引物二聚体是没有了，目的条带还是没出来
1L前辈提到的touch downPCR，用普通的PCR仪能做么？今天问了一下实验室老师，我们只有普通PCR仪，她不知道能不能做Touch down
如果引物基因丰度低的原因所以看不出条带，那做荧光定量PCR可以吗？，荧光定量的灵敏度比普通的高很多，是不是就可以看到扩增曲线了呢？
大仙 (2011-8-23 15:50:21)
QUOTE:
这个不好说，比较早期的PCR仪确实不一定有Touch down程序，但其实很多PCR仪都能做touch down了。你自己多看一下，是否在设定温度或时间的选项旁边有more等字样，里头也许你就能进行温度梯度的设定了。Real-time一般可以扩增出来，但由于扩增出来的不是基因全长，所以对构建克隆没有多大帮助。
我能问一下，你们用的Pfu酶是什么公司的呢？
细水长流 (2011-8-23 15:51:01)
之前用的是takara公司的EX Taq HS
用完了以后换了bioteke的PCR mix 是buffer+dNTPmix+酶预混好的
实验室其他同学用这两种都能做出来……
还有我要扩的片段GC含量不是很高，最高的一个是59%，应该不需要用GC buffer吧
然后我昨天又换了一个cDNA模板做，还是没有扩出来。难道真的是我要扩的基因没有表达么？
我提的是膝关节软骨的总rna，这个基因在神经组织的研究比较多，软骨组织的研究比较少，但也有几篇文献报道过在软骨组织有表达。
+田田+ (2011-8-23 15:51:33)
但是touch down似乎应该是改善引物二聚体和非特异性扩增的问题，对于扩增效率低的问题似乎不能改善吧？
大仙 (2011-8-23 15:52:01)
+田田+ (2011-8-23 15:52:24)
+田田+ (2011-8-23 15:52:24)
大仙 (2011-8-23 15:52:46)
+田田+ (2011-8-23 15:53:22)
跳跳糖 (2011-8-23 15:53:54)
只有引物二聚体没有目的条带，内参有条带