引物二聚体很亮，但目的条带不亮？

字体: 小中大 | 打印发表于: 2011-8-23 16:12 作者: 旋转木马来源: 分析测试百科网

引物二聚体很亮，但目的条带不亮？ [转自丁香园论坛]

这几天在P一个300bp的目的片段，但是一直出现问题！
体系如下：菌液 1
Mg2+ 1.6
buffer 2
dNTP 0.4
上游引物 0.8
下游引物 0.8
无菌水 13.2
DNA聚合酶 0.2
总体系：20微升
反应条件：94度5min， 94 度 30min，65 度30min，72 度 30min，72度10min 35个循环。
所用引物：F:ATGAATTCAAGCTTCAACCCCACGAGCATTTACGAT 长度：36 tm:65.49 GC%:41.67
R:GCCTCGAGTCTAGACTCATAACTAGTGTGAACATT 长度：35 TM:65.59 GC%=42.86 以上参数由生工DNA合成报告单上提供。
由于所用引物比较特殊：5‘均含有两个酶切位点，所以引物很长，另外所扩的片段含有一段3’非转录区（含有较高的GC含量，曾经测序的时候很难，换了几个公司才搞定）。现在跑PCR出现，目的条带很弱，但是引物二聚体很亮的情况。电泳图如下：
望DXJM指教。

查看完整版本请点击这里：
引物二聚体很亮，但目的条带不亮？

21828840.jpg

我也来说两句查看全部回复

最新回复

旋转木马 (2011-8-23 16:13:47)

今天准备把引物浓度降低，把退火温度也降低P一下，不知道可行不？
具体把引物浓度减半，把退火温度降到六十度。
年轮 (2011-8-23 16:14:12)

引物太多了吧，0.4-0.5的量就够了。退火温度多试几个？
旋转木马 (2011-8-23 16:14:40)

今天晚上做的电泳图片：泳道一条件：引物减半，TM 60度
泳道二条件：引物减半，TM68度
旋转木马 (2011-8-23 16:15:01)

今天晚上做的电泳图片：泳道一条件：引物减半，TM 60度
泳道二条件：引物减半，TM68度

如下图：

67423898.jpg
旋转木马 (2011-8-23 16:15:41)

从图中来看，目的条带是存在的，但是更弱了右边是DL2000 marker!
看来温度是不能升了哦！
XDJM 给点建议吧！
HOT兔 (2011-8-23 16:18:21)

你可以试着加快操作流程，酶在倒数第二步加，另外，最好在冰上操作。
旋转木马 (2011-8-23 16:18:52)

酶是在最后一步加的操作是在冰上进行的！
急啊兄弟姐妹再想想办法哦！
阿拉蕾 (2011-8-23 16:19:16)

减低引物的浓度及用量，降低循环数，退火温度在65度附近做个梯度44
旋转木马 (2011-8-23 16:19:48)

今天专门请教了一个做分子很牛的老师她给我的建议如下：
1 用质粒代替菌液做模板。
2 降低引物TM值，不考虑酶切位点。做个梯度，53度，55度，57度，60度。
但愿可以出结果，呵呵！