求助：奇怪，引物浓度对PCR结果的影响

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• 王六六 (2011-8-23 16:51:25)

  一般来说作PCR的时候要保证引物是过量的，因为不用基因的mRNA的丰度是不一样的，所以如果当你要比较不同基因的mRNA量时，如果引物不过量，那么就相当于模版加的不一样多，结果就不可靠了。所以引物浓度，确切的说是每次PCR时引物的量对于实验结果的影响是很大的，一定要保证引物是过量的。

• 牙牙 (2011-8-23 16:51:56)

  谢谢楼上的指教
  可是一般来说，PCR过程中引物浓度不超过1000nM,而我用同样的模版以actin引物来扩增，引物浓度只要400nM.按楼上的说法，actin引物的量也要3200nM 才能扩增出来。这是为什么？

• 大仙 (2011-8-23 16:53:00)

  引物的量和PCR结果有直接的影响那是必然的
  首先，我们考虑一般情况，普通PCR的情况，在标准体系中，引物对PCR结果存在很大的影响，我们可以考虑，在标准体系中，引物减半或者加倍，会是什么情况，我以前有过经验，如果减半，那么PCR结果条有变淡的可能，也有不变的，如果加倍，有变亮的可能，但是也有变化不大的，所以一般来说，引物的用量直接和产物有关，加大引物用量在一定的程度上可以加大PCR的产量，但是引物加大用量也有一个极限，到了这个极限产物不随引物量的增多而增多，不随引物量的减少而减少
  
  其次，我们考虑为什么有的引物的量的变化对PCR结果没有影响，这是因为PCR本身的因素而导致，就好比actin的引物，只要你有引物就可以扩增的一样，引物的量的范围很宽，因为它只起一个参考作用罢了
  
  最后，回答楼主的问题，应该说pcr引物的量和产物有影响，具体的影响结果第一条已经说得很清楚了，但是这里需要补充一点，就是每对引物的效率不是一样的高，还有就是反应的条件等很多因素也对PCR有影响，所以每对引物的适用范围也不一样
  
  好比搂主你的适实验，偶就感觉你的引物的效率在你现在的PCR条件下扩增效率不高。
  
  呵呵一点浅见

• 麻瓜 (2011-8-23 16:53:28)

  楼上的高手，麻烦您再救救我。这几天用原来可以P出来的引物浓度重复做了几次，可是什么条带也没有。再重复做引物浓度梯度和温度梯度，结果也是什么都没有。请问为什么？考虑什么原因？
  救救我，当以为有希望的时候，又陷入深深的绝望

• HOT兔 (2011-8-23 16:53:57)

  我提一个小小的但是必须需要重视的问题，PCR不仅仅和实验条件有关，娴熟的操作手法和习惯也是一个重要因素，相同的实验，不同的人做出来的结果可能会存在很大的差别，我想问问楼主是如何做浓度梯度和温度梯度的，如果你的加样时间太长，也会使实验结果十分不理想的，或者PCR Mix做的不够准确，加到最后几孔可能已经没有Mix了，这说明你前面几孔都是存在误差的；另外，我觉得在摸索PCR反应条件的时候，Mg离子和引物浓度是影响实验结果的主要因素，而其他反应物的反应浓度相对固定。
  最后需要提的一点，我在PCR时也会出现什么结果都没有的情况，我有两种解决办法：1，重复实验； 2，换掉所有的反应物（dNTP,Mg离子，10*Buffer等）重新做实验；3，重新测量引物浓度，重新稀释，重新做PCR
  我个人认为，只要你曾经扩增出产物，就说明你的引物设计的没有问题，只要耐心摸索条件就可以了！！

• 牙牙 (2011-8-23 16:54:22)

  谢谢楼上的指点

• +田田+ (2011-8-23 16:55:03)

  每条引物的浓度0.1～1umol或10～100pmol，以最低引物 量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。