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【求助】抗体片段的HPLC分析
请教论坛里做抗体药物的专家，我做一抗体片段的纯度分析（一类新药，没有标准品），参照药典三部上一般运用电泳和分子排阻HPLC法进行分析，电泳法没什么问题，就是在运用液相分析时不是太清楚相关情况：【求助】抗体片段的HPLC分析
1. 我们的样品里面有单体、二倍体和多倍体同时存在，实验的目的是要得出单体和二倍体的含量
2. 我用常规的缓冲盐溶液进行分析时，根本得不出结果，峰形非常差；而将样品用6M盐酸胍处理后，便能得到理想的峰图和纯度结果
而药典上其他类型的单抗或者重组药物在用分子排阻HPLC法分析纯度时，一般的PBS缓冲液或者PBS含有1%异丙醇即可。请问像我这样将样品用盐酸胍处理后进行HPLC纯度分析的方法是否可行，在进行新药申报时会不会遇到麻烦啊？因为6M盐酸胍时蛋白已经变性了；另外，缓冲盐中加入1%异丙醇的作用是什么，是否会使蛋白变性？
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最新回复
xue258 (2015-8-06 15:26:27)
HP-SEC肯定是非变性条件，变性后dimer和monomer已经没有意义了，按道理纯化后的Fab不会有很乱的峰形，你的图是否能发过来看看？1% IPA是常见的，但很多时候有没有IPA，对最终峰形影响不大。
另外，有可能和你的工艺有关，使用什么样的工艺做的表达和分离？
911 (2015-8-06 15:27:00)
QUOTE:
谢谢！我的样品是scFv，由细菌发酵胞内表达经多步纯化工艺获得，二倍体是单体通过二硫键形成的。请问你说的变性后单体和二体已经没意义了怎么理解？因为我的目的是知道他们的含量即可，当然前提是不改变样品中各组分真实的比例。1%IPA我有做过，有一定作用，但对峰形确实影响不大。
29194080.png
911 (2015-8-06 15:27:21)
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911 (2015-8-06 15:28:30)
ns5fan (2015-8-06 15:28:47)
但你如何确定就一定没有疏水聚集体？或者说最终的质量标准中，是否只关心共价聚集体的含量？
ha111 (2015-8-06 15:29:04)
911 (2015-8-06 15:29:28)
QUOTE:
你说的非常对，如果存在疏水聚合的话，可能这个办法就很难行得通了1. 请教前辈是否可以证明这种作用的存在？怎样证？在第一个图的PBS条件所出峰形是否就能说明这类作用的存在？
2. 我并不关心聚合体的存在形式，只想知道在不改变各组分比例的情况下单体和二体的含量，但我对PBS中盐浓度和pH值均做过一些调整还是发现不行，就如你说的，我感觉组分间确实存在一些非共价作用，才会造成图一的结果，请问可有什么好的建议？
911 (2015-8-06 15:31:53)
QUOTE:
嗯，我也觉得是非共价被破坏了，破坏了非共价可能造成多聚体测得值偏低，但不加盐酸胍的话峰形又没法分析，该怎么办？我觉得即便是存在非共价的聚合体也不一定就会出现图一这种情况吧？电泳图如下
82004215.snap.jpg
newway (2015-8-06 15:33:18)
找一个BSA样品或丙球蛋白，用同样的方法分析一下，如果图很正常，你的方法就没有什么问题。
我没做过细菌表达的ScFv，做过不少动物细胞的ScFv或Fab，HPLC得峰图都比较正常。
当然，如果你认为目前的方法不适合你的品种，需要和中检院等沟通，选择不同的方法来进行纯度分析也是有可能的。
911 (2015-8-06 15:33:42)
QUOTE:
谢谢！原来你是这方面的老专家了，我用BSA和蛋白分子量marker都做过实验，峰图都很好，唯独自己的样品就不行，而且我发现像BSA这样的标准品在我摸索过的几乎所有实验条件下出峰都挺好！真实羡慕嫉妒恨啊！呵呵请问若改用其它检测方法，版主可有好的推荐？或是对目前的方法有什么改进建议吗？
xyw5 (2015-8-06 15:34:14)
看你说了很多，有一点我不大明白你的样品检测纯度，现在除了SEC-HPLC以外，别的方法检测的纯度有多少？是否和你用盐酸胍处理的SEC-HPLC类似？看你的电泳图，左侧是非还原电泳吗？纯度很低啊。别的指标比如离子色谱或者等电点电泳做过吗？
如果样品纯度肯定没有问题，再摸索一下方法，除了盐酸胍，也可以试一下尿素或者去垢剂。
如果样品本身不纯，那就不是你方法的问题了。
dior (2015-8-06 15:36:04)
ns5fan (2015-8-06 15:37:23)
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做过一点SEC，有点不太理解。SEC本身在进样时可能需要稀释，另外在柱上也可能会造成弱结合的二聚多聚的解离。我到现在还搞不清楚SEC和CE-SDS对多聚体测定的区别。文献上好像是说SEC主要是测定可溶解的共价多聚，而非共价多聚（我的理解就是些弱结合的多聚体）因其容易在分析过程中解离而不被SEC检测到（AUC则可以）；CE-SDS或SDS-page由于SDS的分散作用，非共价结合的聚集体也肯定会解离了；感觉SEC和SDS在检测多聚体方面没什么区别，可实际好像是有的，但我不清楚该怎么解释。
另外，用盐酸胍的目的是什么呢？谢谢！
dragonkilly (2015-8-06 15:37:47)
QUOTE:
盐酸胍是变性剂，使蛋白失去活性，其实通过楼主的图谱1与2明显可以看出经过盐酸胍处理后各个成分的百分量已经发生变化，也就是变性后的定量是不准备，并且百分含量也不准，只不过是图形好看了；个人分析，加入盐酸胍后，一些靠非共价键结合的聚体应该被盐酸胍变性后又变成了单体，所以，他的第二个图谱主峰含量明显增大，百分比例也增大，不过这些都是假象，不准确的，中检所也肯定不同意这样的分析方法，楼主后面的小峰是降解片段吧；另外，盐酸胍也“有可能”把共价键结合的聚体变成了单体，不过这方面就需要很深的化学知识了。pou (2015-8-06 15:38:05)
【求助】抗体片段的HPLC分析