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新手请教一个PCR的小问题

字体: 小 中 大 | 打印 发表于: 2011-9-06 11:08    作者: 浆果儿cc    来源: 分析测试百科网

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新手请教一个PCR的小问题
新手请教一个PCR的小问题[转载]


PCR产物电泳，目的条带比杂带还要弱，（目的基因500bp，杂带800---1000bp之间有3、4条）
请问各位大侠怎样解决？
dNTP是不是不能反复冻融？
发现新买的dNTP比以前的dNTP跑得带要亮一些？
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新手请教一个PCR的小问题

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  • 大猫 (2011-9-06 11:09:10)

    大量的dNTP最好分装成小份，但常规的几次冻融不会对PCR产生影响。您遇到的问题主要是PCR特异性问题，可以尝试适当提高退火温度或在反应体系中添加少量的甲酰氨等方法。

  • fangxiang (2011-9-06 11:09:47)

    加少量的甲酰氨的作用是什么？我以前还没用过，烦请赐教！

  • 大猫 (2011-9-06 11:10:23)

    甲酰氨是双链变性剂，添加甲酰氨的作用类似提高退火温度

  • HOT兔 (2011-9-06 11:10:46)

    谢谢！

    但添加甲酰氨与提高退火温度相比，那个更好一点？

  • 大猫 (2011-9-06 11:11:14)

    我一般先提高退火温度，但退火温度的提高是有限度的（72度）。
    如果还不行，再试各种温度下添加甲酰氨

  • fangxiang (2011-9-06 11:11:39)

    真是厉害，退火温度还有要72度以上的，我到目前为止最高的是64度，所以看到后有点吃惊。不知是什么实验要那么高的退火温度，等您有空，告诉我一下。

  • 大猫 (2011-9-06 11:12:30)

    退火温度的设置依据是引物设计时所设定的值。但计算值和实际值之间有几度的差异是很正常的，所以PCR反应一般从一个比预测的退火温度低3-5度的退火温度开始。如果特异性不好，可以适当升高退火温度。有些酶（如TAKARA的pyrobest)在扩长片段是一般推荐使用较高的退火温度，如把PCR温度条件设置成95度30秒，68度3分钟，把PCR每个循环的三步合并成两步。高退火温度有利于扩增模板中有潜在的复杂二级结构的区域。
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