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磷酸盐对酸性磷酸酶活性的抑制作用
关键词：证书标准物质 浊度标准物质 食品添加剂检测 农药标准物质 【实验原理】磷酸盐对酸性磷酸酶活性的抑制作用
抑制剂是引起酶促反应速度降低的一类物质的总称。抑制剂通过与酶的活性部位结合，改变了酶活性部位的结构与性质，从而引起酶活性的下降，按作用分为可逆性与不可逆性抑制两类。
磷酸盐对ACP的抑制属于可逆性抑制，本实验观察磷酸盐KH：PO。对ACP的抑制作用，通过测定不同底物浓度时ACP的活性，然后绘制1／[-S]．1／V曲线判断它是属于竞争性、非竞争性或反竞争性抑制剂。
【试剂与器材】
1．5mmol/L KH2PO4溶液 称取磷酸二氢钾0．68g，溶解于1000ml蒸馏水中。
2．其余试剂同前。
【操作步骤】
除“0”管外其余各管均作平行管，按表操作。
磷酸盐对酸性磷酸酶活性的抑制作用
加入物(m1) 0 1×2 2×2 3×2 4×2 5×2 6×2 7 ×2 8×2 9×2 10×2
磷酸苯二钠 0．50 0．1 0 0．20 0．30 0．40 0．50 0．1 0 0．20 0．30 0．40 0．50
柠檬酸缓冲液 1．10 1．50 1．40 1．30 1．20 1．10 1．30 1．20 1．10 1．00 0．90
5mmol/L KH2PO4 一 一 一 一 一 一 0．20 0．20 0．20 0．20 0．20
酶液 一 0．40 0．40 0．40 0．40 0．40 0．40 0．40 0．40 0．40 0．40
抑制剂终浓度 一 一 一 一 一 一 0．50 0．50 0．50 0．50 0．50
(mmol/L)
37℃水浴15分钟后“0”管加入酶液0．40ml，立即进行下述操作
上述反应液0．50 0．50 0．50 0．50 0．50 0．50 0．50 0．50 0．50 0．50 0．50
蒸馏水0．50 0．50 0．50 0．50 0．50 0．50 0．50 0．50 0．50 0．50 0．50
碳酸盐缓冲液 3．0 3．0 3．0 3．0 3．0 3．0 3．0 3．0 3．0 3．0 3．0
4-AAP 0．50 0．50 0．50 0．50 0．50 0．50 0．50 0．50 0．50 0．50 0．50
高铁氰化钾 0．50 0．50 0．50 0．50 0．50 0．50 0．50 0．50 0．50 0．50 0．50
混匀后，室温放置10分钟，以“O”管调零，在510nm处读取各管吸光度值。用各管吸光度值的平均值在酚校正曲线上查出对应的酚生成量，再换算为nmol／(ml·min)的活性单位用以代表反应速度，分别绘制无抑制剂时(“1”～“5”管)和有抑制剂时(“6”～“12”管)的[S]一V曲线和1／[S]一1／V曲线，根据曲线图形特征判断KH2PO4属于哪类抑制剂。
【注意事项】
实验前需仔细阅读操作步骤，了解各管实际意义再做。
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