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【转帖】实时定量PCR心得
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终于把实验做完了,做的是相对定量法。想把自己做定量PCR写下来,和大家一起分享学习。
1、首先要确定引物的溶解曲线,最好的是一个峰,而且TM值在80度以上,有人说太低可能是D二聚体,但我做过82度的也有D二聚体,所以一定要把产物跑电泳才能确定引物的特异性。
2、配引物一定要在无菌操作台里,因为定量PCR要求比较高,一点污染都会出现非特异性扩增,我就试过引物污染,阴性对照出现扩增曲线。
3、确定引物后要确定模板的浓度,我觉得说明书说的都不准,最好是自己调,把内参和目的基因的CT值调到8到26之间,最低不超过30,太高难以分辨,太低出现非特异性扩增,低的情况溶解曲线也变成多个峰。
4、要做阴性对照,有人说阴性对照是不加引物,有人说是不加模板,我觉得是后者比较好一点。
5、一定要把PCR后的产物跑电泳,因为你机子分辨不了你的产物的大小。我试过溶解曲线很漂亮,但跑出来电泳多条带。
6、有条件就做标准曲线。
7、好的试剂和引物对你的实验帮助大,假如做3次曲线不漂亮,建议换引物或者试剂,定量PCR的引物设计要求比普通PCR的高,建议让专业设计,我的是在宝生物设计的,不错。
希望大家指点,互相学习。
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最新回复
woshi (2015-9-04 15:41:42)
请问楼主:
你买了多少量的试剂盒,摸条件是否顺利,real time 到底好做吗?
我一同学做real time 光摸条件就用去了100多次的试剂,试剂这么贵,呵呵,请多多指教。
园丁## (2015-9-04 15:42:03)
我之前买了一个50次的试剂盒,做了两次曲线不漂亮就不做了,后来换了宝生物的,总共做了四个基因,一个内参,三个目的基因,200次就够了,所以有时试剂不好,你做多少次都很难调得好的。real-time做的好的话,结果比半定量的可靠得多,从结果可以看出不少内参到了20个循环就进入平台期,我们平时做半定量的时候都是用30个循环去做,所以结果差别很大。
爱老虎游tt (2015-9-04 15:42:59)
1、首先要确定引物的溶解曲线,最好的是一个峰,而且TM值在80度以上,有人说太低可能是D二聚体,但我做过82度的也有D二聚体,所以一定要把产物跑电泳才能确定引物的特异性。
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產物的Tm并不規定一個標準的範圍,但儘量在80以上,主要還是要結合電泳結果來看。我做過Tm 79度的。
爱老虎游tt (2015-9-04 15:43:30)
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這個,Ct在8肯定是不准的。ABI儀器自動生成閾值的計算方法是Ct 8-16。大的不要超過35最好,不過我做過Ct 38,電泳產物大小是正確的,數值也拿來用了。哎。
爱老虎游tt (2015-9-04 15:44:52)
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陰性對照不加引物還是頭一次聽說。
爱老虎游tt (2015-9-04 15:45:09)
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同感,我也遭遇過。很令人鬱悶、費解。
爱老虎游tt (2015-9-04 15:46:33)
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這個主要是看選擇什麽方法處理數據。
爱老虎游tt (2015-9-04 15:46:53)
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定量引物和普通引物設計上各有側重,不能籠統的說要求孰高孰低哈,沒有最好的,只有最適合的,哈哈。
园丁## (2015-9-04 15:47:28)
说明书上说阴性对照是不加模板,不加引物的说法是我听一个同学说有个香港的教授说起的,但经过我的考虑觉得是不加模板。
我做的是相对定量,绝对定量要做标准曲线是无可置疑的啦,相对定量我看不少文献和丁香园里的帖子也建议做,一个是看重复性如何,如假如是10倍稀释的话,两者CT值应该是相差3.3吧,假如是2倍稀释,相差是1.二、可以确定哪个CDNA的浓度适合你的实验,诚如楼上所说,太高和太低的浓度都会影响实验结果,而对于CDNA又没有好的方法去测定浓度,所以需要实验中摸索。三、做内参和目的基因的标准曲线可以对照两者的斜率,看两者的扩增效率是否在10%左右,要不结果还要通过公式调整。
对于引物的设计,我查了资料感觉自己还是见识短浅,非常同意楼上的意见。
爱老虎游tt (2015-9-04 15:47:46)
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盲
關於模板添加量的問題,由於cDNA沒有辦法測濃度,只有從RNA,也就是反轉錄前開始調整。把RNA測OD算出濃度后統一調整到一致,然后在反轉錄,做實驗如果感覺不合適的話,可以同等倍數稀釋cDNA,這樣就不至於盲目的摸索模板添加量了,呵呵。
對於一個新領域的茫然感,人人都體會過。那種無助感,甚至都不知道該如何提問。還是樓主仗義,懂得分享。佩服下。
园丁## (2015-9-04 15:50:03)
铜雀 (2015-9-04 15:51:03)
看了两位前辈的心得体会,很是受教!我正在计划做real-time PCR,还在设计实验,两位的心得让我少走弯路了,谢谢两位!
天下虫子 (2015-9-04 15:51:30)
楼主用的是什么方法??什么内参?
cj_mondy (2015-9-04 15:52:00)
1、首先要确定引物的溶解曲线,最好的是一个峰,而且TM值在80度以上,有人说太低可能是D二聚体,但我做过82度的也有D二聚体,所以一定要把产物跑电泳才能确定引物的特异性。
2、配引物一定要在无菌操作台里,因为定量PCR要求比较高,一点污染都会出现非特异性扩增,我就试过引物污染,阴性对照出现扩增曲线。
3、确定引物后要确定模板的浓度,我觉得说明书说的都不准,最好是自己调,把内参和目的基因的CT值调到8到26之间,最低不超过30,太高难以分辨,太低出现非特异性扩增,低的情况溶解曲线也变成多个峰。
4、要做阴性对照,有人说阴性对照是不加引物,有人说是不加模板,我觉得是后者比较好一点。
5、一定要把PCR后的产物跑电泳,因为你机子分辨不了你的产物的大小。我试过溶解曲线很漂亮,但跑出来电泳多条带。
6、有条件就做标准曲线。
7、好的试剂和引物对你的实验帮助大,假如做3次曲线不漂亮,建议换引物或者试剂,定量PCR的引物设计要求比普通PCR的高,建议让专业设计,我的是在宝生物设计的,不错。
希望大家指点,互相学习。
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我准备做,想请教您,是否每个样品都要做标准曲线,还是所有样品做一个标准曲线?
cj_mondy (2015-9-04 15:52:39)
说明书上说阴性对照是不加模板,不加引物的说法是我听一个同学说有个香港的教授说起的,但经过我的考虑觉得是不加模板。
我做的是相对定量,绝对定量要做标准曲线是无可置疑的啦,相对定量我看不少文献和丁香园里的帖子也建议做,一个是看重复性如何,如假如是10倍稀释的话,两者CT值应该是相差3.3吧,假如是2倍稀释,相差是1.二、可以确定哪个CDNA的浓度适合你的实验,诚如楼上所说,太高和太低的浓度都会影响实验结果,而对于CDNA又没有好的方法去测定浓度,所以需要实验中摸索。三、做内参和目的基因的标准曲线可以对照两者的斜率,看两者的扩增效率是否在10%左右,要不结果还要通过公式调整。
对于引物的设计,我查了资料感觉自己还是见识短浅,非常同意楼上的意见。
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内参和目的基因都要做标准曲线吗,只做内参标准曲线可以吗?
vivian4123 (2015-9-04 15:52:55)
不是每个样品都要做标准曲线。但是要做预实验,从多个样品中选择一个样品来作为标准品进行标准曲线的制备,这个标准品要具备的条件是:目的基因和管家基因的Ct值均偏小。
内参基因和目的基因都要做标准曲线,因为未知样品也要同时考察内参和目的基因,只有在各自的标准曲线上才能获得各自的浓度。
阿福 (2015-9-04 15:53:49)
做相对定量的话,只要要对每个目的基因和管家基因做一次标准曲线,这是为了确定基因的扩增效率。
www.1 (2015-9-04 15:55:23)
luoliqiong (2015-9-04 15:55:40)
两大高手·····我想问下结果分析??扩增曲线,溶解曲线,标准曲线怎么看?、刚接触很不懂····望指点,谢谢
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