ABOUT RT-PCR

最新回复

• 韩梅梅 (2011-9-15 15:49:02)

  我不太清楚你的实验目的是什么，看看这篇文章是否有帮助：
  cuturl('http://www.jbc.org/cgi/content/abstract/267/23/16317')
  
  “Vascular endothelial growth factor. Regulation by cell differentiation and activated second messenger pathways”
  
  （cuturl('www.JBC.org/') 267(23) 16317-16322, 1992 claffey et al）
  
  如果你需要Mouse VEGF Fragment,我们倒是可以交流一下。

• 冰激凌小姐 (2011-9-15 15:49:37)

  ABOUT RT-PCR
  
  我准备做VEGF(大鼠)的RT-PCR,引物是在一篇国外文献上抄的,但作者没提供内对照引物,我不知该怎样获得?
  VEGF有4种变异体,因此可跑出4个条带,请问我在购买试剂,引物,以及在试验过程中应注意哪些问题?
  请多指教!
  THANK YOU VERY MUCH!!!
  
  =======================================================
  
  内参照好像大多数用的是GAPDH或beta-Actin，应该有现成的引物买。

• 阿拉蕾 (2011-9-15 15:49:59)

  ABOUT RT-PCR
  
  我准备做VEGF(大鼠)的RT-PCR,引物是在一篇国外文献上抄的,但作者没提供内对照引物,我不知该怎样获得?
  VEGF有4种变异体,因此可跑出4个条带,请问我在购买试剂,引物,以及在试验过程中应注意哪些问题?
  请多指教!
  THANK YOU VERY MUCH!!!
  
  RT-PCR检测VEGF，最终结果跑出几条带，取决于上下游引物的位置。设计引物时应根据自己的目的设计引物。VEGF基因有8个外显子，不同的剪辑体所含外显子不同，如：
          人VEGF121：exon1~5、8
                     165： exon1~5、7、8
                     189：exon1~5、6、7、8
         如果上下游引物在exon1~5，那么RT只有一条带，反映VEGF mRNA的总体水平；如果上游引物在exon1~5而下游引物在exon8，则扩出来为多条带，每条带反映一种剪辑体，如果上/下游引物在第6条，则只扩出189。鼠也应如此，建议查一下鼠的VEGF各种剪辑体的外显子组成，根据自己的目的设计引物。  

• 阿拉蕾 (2011-9-15 15:50:30)

  你是否要做定量的RT－PCR。
  Reagent:
  1，GIBCOBRL的Trizol reagent 可一步法提取组织的总RNA.
  2, Takara 或MBI的one step RT-PCR kit
  Note:
  1, 要尽量取新鲜组织；
  2，所有器械用具用前要用0.1％DEPC处理，消毒；
  3，操作过程中要注意无菌；
  4，不要怕失败。
  关于内对照引物序列很容易在文献查到，也可自己设计，若有困难，我可给你。
  你可以看看mxbdna2003在RT-PCR讨论区的讨论，很深刻。
  你完全可以在RT-PCR讨论区中讨论你的问题，没必要单独再列讨论区。
  以上仅供参考。

• 花裙子 (2011-9-15 15:51:05)

  vegf好像有6个转录本本吧?我曾经帮人看过,年代久远,资料不可寻矣,印象中很难,要讲他们分开似乎不是容易的是,但是掌握一个引物3'碱基的原则,只要不同,还是可以解决的,因为末尾碱基很关键,就可能把他们分开.

• 喵咪 (2011-9-15 15:51:29)

  个人认为TAKARA的一步法RT-PCR试剂盒不是太好，还是INVITROGENE的MMLV，Superscript2/3等好，可以自己用RT酶和PCR kit配两步法的试剂盒，两步法的好处还在于设置多个对照，出了问题容易找到原因，对初试者尤其有好处。而且RT产物（cDNA）可以做20个PCR，用于多个基因的扩增。

• 麻瓜 (2011-9-15 15:51:53)

  各位兄台：
  
  我已经2个月没p出东西了。开始的时候还是有目的片断，后来我想优化条件，结果越优化越遭，什么也没有了。上个星期又重新定了引物（我曾怀疑以前的引物降解了），还是什么都没有，跑出来得都是比目的片断偏小的smear,我快愁死了，帮帮我吧！急盼！

• 不懂 (2011-9-15 15:52:27)

  我觉得您的实验还是需要阳性对照来说明问题，如果对照没有问题，那就是样品制备或引物出问题的可能性较大了

• 麻瓜 (2011-9-15 15:53:03)

  β-actin已经跑出来了,所以引物出问题的可能性极大,但是在我怀疑引物降解后又换了一家公司重新合成了一次,但还是p不出东西来,怎么办?真急死了!