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求助：亚克隆后测序问题

字体: 小 中 大 | 打印 发表于: 2011-9-16 12:50    作者: 麻瓜    来源: 分析测试百科网

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求助：亚克隆后测序问题
求助：亚克隆后测序问题 [转载]


我把一段300b大小的DNA插入到4kb左右的质粒里，然后用EcorI消化了再电泳验证了是两条带，是可以的。接下去是要测序，有人叫我把已插入DNA的质粒做PCR for sequence，引物3.0微升，是用M13forward 或者是M13reverse，再是用BD2.0微升和half BD微升，水5.8微升，请问各位，插入300b大小DNA的质粒是个环形的东西，那么PCR后的产物是不是都是一个个环形的产物呢？这样测序能测出来吗？因为我不是分子生物学专业的，搞不懂这些，请各位帮帮我吧，谢谢。
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  • @花开花落@ (2011-9-16 12:51:26)

    DNA插入到质粒后，与质粒的DNA连接在一起，质粒的整个DNA是环形的，但你的靶基因是线性的，测序所用的引物，在质粒上选择性的批出一段含靶基因的DNA片段，也是线性的。所以你不必担心。

  • 糊涂虫 (2011-9-16 12:51:49)

    没什么问题，可以测出来。
    测序都是这样的过程。

  • 麻瓜 (2011-9-16 12:52:11)

    可是在PCR for sequence的时候，我只用一个引物比如M13forward，引物朝一个方向延长的时候会不会绕了一整圈然后又形成一个环形产物呢？我用的质粒是pCR4－TOPO（invitrogen公司的）。谢谢。

  • 麻瓜 (2011-9-16 12:52:42)

    如果是环形产物，用来测序行吗？谢谢大家了，拜托。

  • 椰子叶子 (2011-9-16 12:53:28)

    在没有DNA连接酶的作用下，不可能自动形成环形产物。

    更关键的是PCR for sequence的反应，由于掺入了ddNTP，反应的产物都是一些大小不一的线性片段，更加不会有你担心的环形产物出现。

    题外话：
    你最好看一下关于测序的一些基本原理。

  • ffaa (2011-9-16 12:53:57)

    理论上可以形成你说的那种不断走下去的dd
    象个螺旋状的产物
    不过实际上测序一般都只能到5，600bp那么远

  • 麻瓜 (2011-9-16 12:54:32)

    理论上可以形成你说的那种不断走下去的dd
    象个螺旋状的产物
    不过实际上测序一般都只能到5，600bp那么远

    =============================

    我的质粒只有4000bp不到啊，谢谢你。

  • 椰子叶子 (2011-9-16 12:54:57)

    是，500~600bp而不是5600bp，你理解错了吧！
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