实验中的疑问

最新回复

• #甜# (2011-9-20 15:36:40)

  常规工作，怎么不可以。你说一下你的实验过程，大家帮你判断一下。

• 8黑眼圈8 (2011-9-20 15:37:01)

  提RNA的新手大多有这样的经历，如果经费比较充足的话还是买KIT比较省事的，不用将宝贵的时间花在这样的纯粹的体力劳动上了。将空出来的时间花在上DXY上与老哥哥老姐姐们交流交流一准会事半功倍。

• +田田+ (2011-9-20 15:37:25)

  我刚做完RNA提取，我们实验室条件也不好，没有专门的实验室，没有专门的加样器，大家都在一个实验室，但我一般都在晚上提，这样可以避免污染。另外，在处理所有实验用品的时候，一定要仔细、小心。我不知道你的实验条件，我做的结果还可以。可能的话，你把实验记录发一份看一下，我们共同探讨。

• 萌芽 (2011-9-20 15:37:59)

  只要标本保存的好，量充分（每次约50毫克）。你肯定可以提出RNA来。我曾经故意用没有经DEPC处理过的吸头EP管来提取RNA，结果一样好。室温放置一夜后再跑电泳也只有少许降解。我的经验是，关键标本要保存的好，提取的过程就算有部分降解，拿来做RT-PCR时绝对没问题的。

• 晶晶亮 (2011-9-20 15:38:28)

  用KIT 保险点.别舍不得这钱,可省很多时间.QIGEN的很不错,提RNA一两小时可搞定.

• wawa (2011-9-20 15:39:29)

  非常感谢各位前辈的热心关怀与指导！
  下面是我的实验方案：所有的器具，所用试剂均按照标准进行灭酶，灭菌处理。（0.2%DEPC浸泡12小时，玻璃器具180度干烤一夜）。
  从霉菌中提取RNA，菌体收集后-70度冰箱中保存。
  用Takara kit提取，菌体量用25mg（量太多裂解液裂解效果感觉不好）
  最好的一次结果OD260/OD280=1.4左右，甲醛变性凝胶电泳结果无条带出现。
  实验室条件也不好，没有专门的实验室，加样器，电泳仪专用，其他仪器大家公用。
  恳请各位长辈给予一定的指导。

• 岸上的鱼 (2011-9-20 15:39:59)

  不知道你用的是什么裂解液？
  有一些标本由于结构的特殊（如结核杆菌细胞壁含有大量的脂质），所以要应用一些特殊的裂解液，我们实验室有这方面的专门材料，但我记的不太清楚了，明天回去会帮你查查。  

• 橘子水儿 (2011-9-20 15:40:40)

  我提total RNA是用invitrogen的TRizol从组织中提的,方法如下: 我怀疑你的菌体裂解不够完全.
  
  血吸虫成虫总RNA的提取
  
  称取500mg（湿重）成虫，按试剂盒说明进行总RNA的提取，得300µl RNA溶液。按1:100的比例稀释后，测其A260 和A280并计算纯度和含量。
  
  1)  将500mg成虫放入玻璃匀浆器内，加入5ml 4℃的TRIzol试剂，于冰上匀浆10min；
  2)  分离：将匀浆好的样品转移到3个EP管中，放15~30℃孵育5min，每管再加0.5ml氯仿，用力振荡15sec，放15~30℃孵育3min，2~8℃ 12000g离心15min；
  3)  RNA沉淀：将上层液相转移到3个新EP管中，每管加0.5ml异丙醇混匀，放15~30℃孵育10 min，2~8℃ 12000g离心10min；
  4)  RNA洗涤：去上清，每管加1ml 75％的乙醇，用涡悬混匀器振荡，然后2~8℃，7500g离心5min；
  5)  RNA溶解：短暂干燥RNA后，每管加100µl DEPC处理的去离子水溶解RNA；
  6)  将RNA按1:100的比例稀释后，用紫外分光光度计测其A260 和A280计算纯度和含量。以及下面公式分别计算RNA的纯度和含量：
  [RNA]=A260×稀释度/25（μg/μl）
  （如果获得的总RNA量＜50μg，则不应进行以下步骤——从总RNA中分离polyA+RNA。

• SOS (2011-9-20 15:41:12)

  我得裂解液是catrimox takara的试剂，我又做了几次，改变菌体量等参数，能指导一下，操作中÷的一些关键步骤（你们实际的经验）

• SOS (2011-9-20 15:41:12)

  我得裂解液是catrimox takara的试剂，我又做了几次，改变菌体量等参数，能指导一下，操作中÷的一些关键步骤（你们实际的经验）