求助各位：引物设计

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• 长发piaopiao (2011-9-21 15:43:16)

  老板要我根据674－697的碱基来设计一条上游引物，在1340－1358的碱基设计一条下游引物，上游引物加ECORI,下游引物加BAMHI,我自己用PRIMER5 摸索了几天，看了很多帖子，但现在还是上不了手。几个设计的基本的原则虽然我懂一些，但是就是拿到特定碱基序列不知道怎么下手。求助哪位战友帮帮忙，具体讲一下一步一步到底该怎么做，细节具体一些？万分感激啊  

• +田田+ (2011-9-21 15:43:43)

  这种设计不需要premier5，因为你要求的区域太短，只有20bp左右，你可以直接在里面找一段并按照引物设计原则看看就可以，如果实在想用premier5你可以在search的时候设置sense primer为674-697,anti-sense为1340-1358，然后设置引物长度就可以了。

• 长发piaopiao (2011-9-21 15:44:13)

  首先很感谢您的讲解，深表敬意。
  我现在的困难是这23个BP的序列我不知道怎么设计，昨晚，我用
  PRIMER5把674－697找了一下ctgggca ttttcaagaa gcacat这段序列的引物，但是反义引物找不到，正义引物又太短，只有18－19个，不符合实际的原则。
  我这段目的基因里
  1。有多聚G,多聚T，设计引物时怎么办呢？
  2。上游引物加ECORI的酶切位点加在5‘端，到底加在哪个碱基 序列位置比较好呢？
  3。我就按照该目的基因的互补序列来互补出引物吗？
  4 而且我想要引物的长度最后在25－28个，那怎么根据这个短的目的基因序列来做呢
  还请大家不吝赐教，具体帮我设计一条出来做个示范，讲解一下原因，万分感谢了
  
  盼回复

• +田田+ (2011-9-21 15:44:59)

  这个要求实在是很难，有时候设计引物不一定非要按照原则，只要差不多可以，你可以先设计一个试试。其实你可以先在这个区间外围设计一对非常合适的引物（搜索sense再697之前和anti-sense在1358之后），pcr出目标带后（可以加上回收纯化）再用你要求的区域内引物做内缩，即使引物不是很好一般也可以成功。

• 长发piaopiao (2011-9-21 15:46:40)

  另外问一下内缩是什么意思，让您见笑了

• 长发piaopiao (2011-9-21 15:46:40)

  另外问一下内缩是什么意思，让您见笑了

• +田田+ (2011-9-21 15:51:41)

  内缩是俺们的土话，专业术语大概叫套式或巢式pcr。就是先用设计的外引物扩增得到清晰片断后再用内引物扩增你要的那段。

• 爱哭鬼 (2011-9-21 15:52:09)

  sense:保护硷基+酶切位点+catctgggca ttttcaagaa gcacatt
  antisense:保护硷基+酶切位点+终止密码子+cgcaggtg tctagaaggta
  再用引物设计软件评价一下，如果没有引物二聚体和发卡结构就可以去合成了！
  祝你好运！

• 长发piaopiao (2011-9-21 15:52:58)

  非常感谢KINGKUO和PPCAT战友的帮助，我现在经二位指点总算入了一点门，对设计引物有了一些兴趣。
  我把KINGUO君的设计看后，觉得有些不对劲，
  另外请问KINGUO君，为什么反义引物要加上终止密码子，我的引物只用于克隆，不用表达，还要不要加呢？

• 8黑眼圈8 (2011-9-21 15:53:24)

  那就根据情况而定了

• +田田+ (2011-9-21 15:54:01)

  估计dingding是要做杂交吧，这样就应该不需要终止密码子