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关于real－time PCR的引物二聚体的问题

字体: 小 中 大 | 打印 发表于: 2011-9-21 16:34    作者: 了了    来源: 分析测试百科网

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关于real－time PCR的引物二聚体的问题
关于real－time PCR的引物二聚体的问题 [转载]


做了real－time PCR，由于是用SYBR作为染料，因而引物的二聚体对于我的实验影响很大。出来的结果可以在熔解曲线中明确的看到：在做标准曲线的时候，随着模板的减少（稀释度增加），引物二聚体的峰增大（其Tm值约为72度），而我的目的条带的峰减少（其Tm值82度左右）。阴性对照中也可以看到引物二聚体的峰。但是在扩增曲线中，由于无法把这两者分开，造成实验结果的无法处理。引物二聚体的峰出来的循环大约在23左右，并不是很晚。
由于实验条件的限制，我没法用Taq Man 探针来做。所以我想请教各位：
SYBR这种方法能够得到比较好的结果吗？
我做的是细胞因子方面的，有没有人有很好的引物？
如果大家有这样的经验，能讨论一下，并给我一些建议吗？谢谢。
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最新回复

  • 碧空子 (2011-9-21 16:36:37)

    如果你的阴性对照也出现引物二聚物的峰，那么要么优化体系，减少引物二聚物，要么重新设计引物。
    如果各方面做好了，SYBR可以做到很好的结果的。我自己的感觉优化体系更重要些。

  • 喵咪 (2011-9-21 16:38:07)

    如果你的阴性对照也出现引物二聚物的峰，那么要么优化体系，减少引物二聚物，要么重新设计引物。
    如果各方面做好了，SYBR可以做到很好的结果的。我自己的感觉优化体系更重要些。

  • 了了 (2011-9-21 16:38:41)

    谢谢，但优化体系的工作是否是先在普通的PCR上进行呢？

  • 阿福 (2011-9-21 16:39:04)

    一个关键问题是你的引物终浓度是多少，太高容易出现引物二聚物的峰，我自己摸过这浓度，我现在用在100nM不会出现引物二聚物的峰，你可以从200-50nM试试，找到一个合适的，既不会有引物二聚物的峰也保证不会太大的cycle。优化体系的工作应在real-time PCR仪上进行。阴性对照的二聚体的峰应该是很低的，而且不会是那种持续上升的趋势，你也可以将threshold的值人为往上提点。

  • 了了 (2011-9-21 16:40:02)

    我用的引物的终浓度是：250 nM; 我下回按你的方法摸摸条件吧。谢谢。
    还有一个问题，大家用什么模板来做标准曲线的？

  • 了了 (2011-9-21 16:41:08)

    我用的引物的终浓度是：250 nM; 我下回按你的方法摸摸条件吧。谢谢。
    还有一个问题，大家用什么模板来做标准曲线的？

  • babybabe (2011-9-21 16:49:12)

    质粒DNA。  

  • 了了 (2011-9-21 16:49:55)

    谢谢。
    不好意思，再麻烦一下，如果不用质粒DNA，有没有其他的办法呢

  • 岸上的鱼 (2011-9-21 16:55:27)

    你用的是什么机器？有的机器（比如罗氏的）可以自己定一个温度测荧光度值，你可以在引物二聚体的Tm值（72度）和目的条带的的Tm值（82度）之间选择一个温度进行测荧光度，或许可以避免二聚体的影响！  

  • flower@@ (2011-9-21 17:23:43)

    谢谢。
    不好意思，再麻烦一下，如果不用质粒DNA，有没有其他的办法呢

    ==================================================================

    做相对定量的有用样本或细胞株做。
    绝对定量，我觉得首选首选是质粒DNA。纯化PCR产物也可，但是总是不如质粒DNA好。

  • PINK (2011-9-21 17:28:33)

    谢谢。
    不好意思，再麻烦一下，如果不用质粒DNA，有没有其他的办法呢

    ==================================================================

    做相对定量的有用样本或细胞株做。
    绝对定量，我觉得首选首选是质粒DNA。纯化PCR产物也可，但是总是不如质粒DNA好。

  • 红豆冰 (2011-9-21 17:36:17)

    绝对定量，我觉得首选首选是质粒DNA。纯化PCR产物也可，但是总是不如质粒DNA好。

    =============================

    为什么纯化PCR产物不如质粒DNA好呢?

  • 海鸥crazy (2011-9-21 17:37:47)

    现在做实时荧光定量RT－PCR也遇到二聚体的问题，和楼上的差不多，我也是用SYBR Green做染料，primers的浓度是100nM，标准曲线下确实看到二聚体的峰，但内参做的很好，几乎没有任何二聚体出现，我已经换了B－actin和RP2两种内参了，每个都表现很好，就是我的target gene的效率太低，造成无法得到预期结果。请主任指点一下，如何改进，多谢！

  • qqq111 (2011-9-21 17:38:09)

    请教.准备做allelic discrimination Real-time PCR, 先设计并制造了引物, 我想鉴定一下引物是否能扩增出PCR产物,是否看dissociation curve就行了.有2个峰是吗?
    可是如何看到dissociation curve呢?是不是在thermal cycler 设定时,选定dissociation protocol选择框?不选9600emulation框?*(ABI prism 7000仪器). 我已做了一次PCR, (用的9600emulation框),产物都看不到dissociation curve.所以我不知道有没有PCR产物,及引物是否好. ABI prism 7000仪器是否默认选项是不产生dissociation curve,得自己另外测定?

  • dreaming (2011-9-21 17:39:56)

    可以尝试用Hot-Start的Tag酶，我作过Hotstart和普通Tag酶在 Real-time PCR上的比较，两者在引物二聚体上差别非常大，我想原因也就是引物二聚体的Tm值比较低吧？
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