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【求助】凝胶进行了在位清洗（CIP），过程如下：

字体: 小 中 大 | 打印 发表于: 2015-10-27 10:43    作者: 大大    来源: 分析测试百科网

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【求助】凝胶进行了在位清洗（CIP），过程如下：
我使用的是Q-琼脂糖凝胶，以前一直是好好的，但是因为用的次数比较的多了，所以柱子上由于结合了许多的疏水性结合蛋白，使得我的目的蛋白无法结合上去，于是我就对凝胶进行了在位清洗（CIP），过程如下：1M NaOH清洗6-8倍体积—70%乙醇清洗6-8倍体积，再用ddH2O清洗10倍体积，最后再用上样缓冲液清洗4倍体积后上样。
      在位清洗后奇迹发生了，首先，我以前用20 mM NaCl可以洗脱下来的蛋白质现在无法洗脱下来了，需要用2 M NaCl才能洗脱下来（电泳结果可知）；其次，洗脱下来的蛋白都已失活。乙醇清洗后用ddH2O洗了十多倍体积，应该不会是乙醇的问题，所以现在我一时也不知道问题出在哪里了，想看看各位高手对次有什么看法。
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  • 今生如此 (2015-10-27 10:43:44)

    NaOH的问题？你的柱体积是怎么确定的

  • dadaai (2015-10-27 10:44:14)

    不要使用Q柱了，结合力太强。换个弱阴离子柱。
    我感觉是以前你柱子太脏，蛋白结合的很弱，所以很容易洗脱，现在柱子赶紧了，展现出真正的结合能力。
    2m nacl我感觉一般蛋白耐受不了。   可以先把未纯化的蛋白放在里面试试，看看失活不。不失活就是柱子的原因了，意味着你还的换柱子。

  • 大花猫bb (2015-10-27 10:44:44)

    请教下楼主怎么看蛋白失没失活啊

  • 小女人@ (2015-10-27 10:45:18)

    先将柱子装一定量的水，在柱子上标好刻度，就可以知道你的柱床体积了。

  • 冰激凌 (2015-10-27 10:45:48)

    应该不是2M NaCl的原因，因为我以前也用2 M的NaCl洗脱过，只是那时候是用的是弱阴离子交换柱DEAE-琼脂糖凝胶而已，因为是20 mM就可以洗脱下来，2M洗脱只剩一点点残留的蛋白，但是还是可以检测到活性的。而这一次是一丝的活性都没有。

  • daomei (2015-10-27 10:46:20)

    是的呀，不然的话很难检测蛋白是否变性的。

  • danzi (2015-10-27 10:46:53)

    请问你怎么确定乙醇没有残留，没必要用乙醇清洗的啊，就是洗的话用百分这二十也就可以了，我们以前都是用NAOH清洗就行了，然后用水把PH直冲到和缓冲液的PH值差不多，不是冲多少个体积就可以把柱子里的残存冲干净，而要看PH值的。

  • 今生如此 (2015-10-27 10:47:31)

    我觉得柱子没有平衡好  pH太高  致蛋白失活  变性后蛋白沉淀在柱子内 还有可能产生特异性吸附  所以需要较高浓度盐才洗下来……建议用20%乙醇+1M NaCl的酒精盐溶液进行清洗，然后平衡柱子。
    用碱清洗后的柱子一般在上loading buffer之前先用高浓度缓冲液冲洗

  • 小妖精@ (2015-10-27 10:48:03)

    蛋白质检测看是否结在一起啊 ....它是胶体....如果变质的话...它的颜色应该会发生变化.........

  • 哈密瓜 (2015-10-27 10:48:34)

    因为我是清洗了之后用真空泵抽滤过的，将液体抽滤干净之后再用缓冲液平衡的。这样的话应该是没有 残留的吧。

  • QQ爱 (2015-10-27 10:49:10)

    颜色这些都没有问题，看上去都很正常，就是没有活性。

  • n111 (2015-10-27 10:49:42)

    我是按照说明书上的做的，可能真的是这些在位清洗的浓度太高了，导致还有碱的残留，我还是再试试，看看洗脱液的pH吧，谢谢你了！

  • qinqinai (2015-10-27 10:50:13)

    你平衡了几个柱体积，有没有测过PH,在有就是蛋白对PH要求也是比较苛刻的，过酸过碱都会失活变性的。

  • xiaoxiaoai (2015-10-27 10:50:45)

    我同意二楼的说法，如果这个柱子不是你第一个用的，那二楼说的就更有可能了。

  • 钻石 (2015-10-27 10:51:23)

    氢氧化钠不会那么容易除去的，我水洗之后用20%的乙醇保存，过两天之后把20%的乙醇洗出去的时候发现是臭的，说明残留的氢氧化钠在层析柱里有反应。即使用水洗至pH为中性，也还是有残留的，这可能与层析柱内填料装填得紧密有关，极少量的氢氧化钠在旮旯里残留，我觉得你可以试一下放两天之后再继续用，这时候可能氢氧化钠就完全出来了。
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