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TAQ酶的突变率,我的担心
TAQ酶的突变率,我的担心 [转载]TAQ酶的突变率,我的担心
大家好.我现在在做一个665BP大小的片断,我本用PFU酶做,去怎么也做不出来,所以我想改用TAQ酶做,可我听说TAQ酶的突变率较高,我想请问一下各位的经验,你们觉得665大小的片断,用TAQ酶合适吗?
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TAQ酶的突变率,我的担心
TAQ酶的突变率,我的担心
字体: 小 中 大 | 打印 发表于: 2011-9-22 11:48 作者: 头发很短 来源: 分析测试百科网
最新回复
babybabe (2011-9-22 11:50:59)
关键在于反应体系中dNTP混和物浓度不能太高
可以试试做个依次递减4倍的剃度
取能做出来的最小浓度体系送去测序
循环数也同样尽可能的少
这样taq的突变率在1/1000左右
送2个测序就够了
#甜# (2011-9-22 11:51:34)
喵咪 (2011-9-22 11:51:58)
关键在于反应体系中dNTP混和物浓度不能太高
可以试试做个依次递减4倍的剃度
取能做出来的最小浓度体系送去测序
循环数也同样尽可能的少
这样taq的突变率在1/1000左右
送2个测序就够了
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完全同意！
果冻也酸 (2011-9-22 11:52:28)
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放心吧，肯定不会有突变的，这个我做过，我P 1300BP的片段就是用一般的TAQ酶做的，没一个突变，而且前前后后做了数十次，没有一个突变，我现在敢说一般的TAQ酶在1000BP以内的突变率是零。而不是什么1/1000，分子可隆上说是在1/10000 以下。你的才665BP，小CASE。
不过你用PUF酶没做出来，这个问题到是值得去好好的思量一下，问题出在什么地方。不应该P不出来的。
麻瓜 (2011-9-22 11:52:56)
质疑，质疑？
+田田+ (2011-9-22 11:53:32)
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呵呵，有位高手是做长片段的，他用普通的TAQ酶P过3000BP的。 你如果是没做过，可以去看看。
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=67&id=591772&sty=1&tpg=1&age=0')
我知道很多贵族用高级的聚合酶用的多，反而对普通的TAQ酶到是不了解，普遍现象
格格巫 (2011-9-22 11:53:59)
韩梅梅 (2011-9-22 11:54:24)
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如果有朋友不放心的话，用用这个方法也挺好！
韩梅梅 (2011-9-22 11:54:58)
斑竹老大有没有什么好注意啊！！
雷子! (2011-9-22 11:56:31)
黄培堂 俞炜源 陈添弥 等译
科学出版社 北京 2002
Enz. dNTP (mmol/L) pH Mg (mmol/L) 每循环的效率(%) 错误率 PCR引起的突变a（%） 需要的循环数b 参考文献
pfu 0.10 8.4 1.5 60 7.0×10-7 0.3 30
T4 2.15 8.0 5.0 56 6.0×10-6 2.0 32
T7 3.50 8.0 2.5 90 4.4×10-5 13.0 22
Vent 0.50-1.50 8.5 7.5 70 4.5×10-5 16.0 26
Taq 0.50-1.50 8.0 5.0 36 7.2×10-5 25.0 45
Taq 16.6 8.8 10.0 88 2.0×10-4 56.0 22
Klenow 1.50 7.9 10.0 80 1.3×10-4 41.0 24
雷子! (2011-9-22 11:56:31)
黄培堂 俞炜源 陈添弥 等译
科学出版社 北京 2002
Enz. dNTP (mmol/L) pH Mg (mmol/L) 每循环的效率(%) 错误率 PCR引起的突变a（%） 需要的循环数b 参考文献
pfu 0.10 8.4 1.5 60 7.0×10-7 0.3 30
T4 2.15 8.0 5.0 56 6.0×10-6 2.0 32
T7 3.50 8.0 2.5 90 4.4×10-5 13.0 22
Vent 0.50-1.50 8.5 7.5 70 4.5×10-5 16.0 26
Taq 0.50-1.50 8.0 5.0 36 7.2×10-5 25.0 45
Taq 16.6 8.8 10.0 88 2.0×10-4 56.0 22
Klenow 1.50 7.9 10.0 80 1.3×10-4 41.0 24
blueeye (2011-9-22 11:58:38)
快乐的大脚 (2011-9-22 11:59:19)
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这下放心了吧， 普通TAQ的突变率在1/5000以下。呵呵。你的665BP，可以绝对的放心。
通过与各位大虾的交流，也让本人受益匪浅。但不知大家对TAQ酶的聚合能力是否了解，有个老兄说在2000BP/M 以上，我从书上看到过900到1200BP。
快乐的大脚 (2011-9-22 11:59:40)
黄培堂 俞炜源 陈添弥 等译
科学出版社 北京 2002
Enz. dNTP (mmol/L) pH Mg (mmol/L) 每循环的效率(%) 错误率 PCR引起的突变a（%） 需要的循环数b 参考文献
Taq 0.50-1.50 8.0 5.0 36 7.2×10-5 25.0 45
Taq 16.6 8.8 10.0 88 2.0×10-4 56.0 22
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怎么是一样的东东！
阿拉蕾 (2011-9-22 12:00:03)
你扩增不出600多bp片段的原因，我分析可能如下：
1.引物问题：引物不合适是引起PCR扩增失败的一个主要原因，而许多人对此认识不足。600bp左右的目的片段，引物长度在20bp左右即可，Tm值一般在60度左右较好。引物对之间的Tm相差最好不要大于3度，GC含量差别不要超过5%。当然，你可以通过调节长度来补充GC含量的差别。所以，设计引物时，本人强烈推荐不要盲目相信自动设计和合成引物产家的设计。而要观察，比较。
2.扩增区域DNA的问题：请对你要扩增区域的600多bp的序列进行分析，GC含量是否过高（超过55％）？如果GC含量过高，建议使用TAKARA公司的LA-Taq，用GC buffer来扩增。是否在目的区域或附近存在二级结构？如果是，建议将引物Tm值设计得高点，如66度，用高退火温度扩增。
3.Taq酶的问题：一般而言，600bp左右的片段，用任何形式的Taq均能扩增出。但是，pfu的扩增效率比较低，如果你的模板不好，而pfu的质量又不是特别佳的时候，也可以导致扩增失败。在这里，我想告诉你的是，对于600bp左右的片段，完全没有必要用Pfu来扩增，一般Taq的保真性，绝对没问题。我非常同意charlis789 的看法。
4.模板问题：模板制作不好，用再好的酶也白搭！建议你最好用传统的酚－氯仿法抽提DNA，比色定量后，按100微升反应体积，加500～1000ng左右的模板，进行扩增试试。
当然，还有其他可能的原因。但是依我10多年的经验，只要模板好，引物佳，Taq适合，一般PCR都能成功。
祝你好运！
@花开花落@ (2011-9-22 12:02:38)
当然，还有其他可能的原因。但是依我10多年的经验，只要模板好，引物佳，Taq适合，一般PCR都能成功。
祝你好运！
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呵呵,Bloodreview兄说的有点太保守了,模板好，引物佳，Taq适合，P不出来就是见鬼了..我并不看重引物的性质,长度不要非常长,(120BP以上))也不要非常短(就算是15个吧),GC含量我用过最高的百分之83,发夹结构也关系不大,我用过有两个发夹结构的.都是最多两次,OK.
主要是你的模板要确定,质量适中就行!!!(是不是有点吹了,却是实话! 呵呵)
TAQ酶的突变率,我的担心