PRIMER3‘端的问题

最新回复

• 椰子叶子 (2011-9-22 12:04:55)

  Taq DNA聚合酶没有3'-5'外切酶活性，所以3'端错配会影响延伸效率，使产物的量大大降低.。A:G、G:A、C:C、G:G的3'末端错配可使产物量减少100倍，A:A减少20倍，其他的错配影响相对较小。  

• 大猫 (2011-9-22 12:05:17)

  世事没有绝对!
  但是如果3‘段发生了错配，>99%以上的可能性是没有产物扩增。
  扩增出来的可能性还是存在的，但是效率很低很低很低。。。。

• 爱哭鬼 (2011-9-22 12:05:35)

  有时候设计引物是没的选择的，如果的确不能摆脱错配，在设计的时候尽量选择TM值高一些的引物，这样可以提高特异性，减少错配发生。

• 兔two (2011-9-22 12:06:48)

  最后一个碱基不能配对，否则没有pcr产物了

• seven7 (2011-9-22 12:07:29)

  世事没有绝对!
  但是如果3‘段发生了错配，>99%以上的可能性是没有产物扩增。
  扩增出来的可能性还是存在的，但是效率很低很低很低。。。。
  
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  您这么说，我就放心了，哈哈

• seven7 (2011-9-22 12:07:56)

  最后一个碱基不能配对，否则没有pcr产物了
  
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  我是问错配
  
  您说的配对是什么意思？
  
  请指点

• @木木@ (2011-9-22 12:08:23)

  如果引物3‘端最后一个碱基错配，在较低的退火温度有时还是能够扩增出片段的。
  我曾经为了验证一个点突变，设计过等位基因特异性PCR。即设计2条引物：针对突变的引物和针对野生型的引物，该2条引物只有3’最后一个碱基不同。然后用此2条引物分别与相同的一条下游引物配对去分别扩增突变体和野生型，结果发现：虽然最后一个碱基并不配对，但是在58～66℃退火时突变引物也可以扩增出野生型；野生引物也可以扩增出突变体。而当退火温度升到68℃时，突变引物不能扩增出野生型，而只能扩增出突变体；同样，野生引物也只能扩增出野生型。
  所以，引物3‘端的最后一个碱基错配并非绝对不能扩增出片段，而是与退火温度有关。当退火温度较低时，即使有错配，由于普通Taq缺乏3'-5'外切酶活性，也会造成扩增。

• seven7 (2011-9-22 12:08:58)

  如果引物3‘端最后一个碱基错配，在较低的退火温度有时还是能够扩增出片段的。
  我曾经为了验证一个点突变，设计过等位基因特异性PCR。即设计2条引物：针对突变的引物和针对野生型的引物，该2条引物只有3’最后一个碱基不同。然后用此2条引物分别与相同的一条下游引物配对去分别扩增突变体和野生型，结果发现：虽然最后一个碱基并不配对，但是在58～66℃退火时突变引物也可以扩增出野生型；野生引物也可以扩增出突变体。而当退火温度升到68℃时，突变引物不能扩增出野生型，而只能扩增出突变体；同样，野生引物也只能扩增出野生型。
  所以，引物3‘端的最后一个碱基错配并非绝对不能扩增出片段，而是与退火温度有关。当退火温度较低时，即使有错配，由于普通Taq缺乏3'-5'外切酶活性，也会造成扩增。
  
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  好，那么等位基因特异性PCR就不是那么理想了，是吧
  
  既然和退火温度的优化的关系这么大的话

• @木木@ (2011-9-22 12:10:20)

  好，那么等位基因特异性PCR就不是那么理想了，是吧
  
  既然和退火温度的优化的关系这么大的话
  
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  你好！
  首先需要说明的是等位基因特异性PCR（AS-PCR）在使用时必须要有阳性和阴性对照。调节AS-PCR的敏感性要以阳性能扩增出，而阴性扩增不出为对照。
  AS-PCR的确与退火温度的优化有很大关系。但是由于有时为了验证点突变的存在，而又突变又没有导致内切酶位点的改变，只好使用ASPCR。所以也有数种方法可以来调节AS-PCR的敏感性。
  1. 可以在引物3‘端倒数第3或4碱基处再设置一个错配碱基，这样就形成了两道gate，即使引物因为冲破第一次错配而扩增，也难以突破第二次错配。
  2 .可以用减少循环次数来调节AS-PCR的敏感性。我以前曾用过25个Cycle来成功完成AS-PCR。

• seven7 (2011-9-22 12:10:56)

  你好！
  首先需要说明的是等位基因特异性PCR（AS-PCR）在使用时必须要有阳性和阴性对照。调节AS-PCR的敏感性要以阳性能扩增出，而阴性扩增不出为对照。
  AS-PCR的确与退火温度的优化有很大关系。但是由于有时为了验证点突变的存在，而又突变又没有导致内切酶位点的改变，只好使用ASPCR。所以也有数种方法可以来调节AS-PCR的敏感性。
  1. 可以在引物3‘端倒数第3或4碱基处再设置一个错配碱基，这样就形成了两道gate，即使引物因为冲破第一次错配而扩增，也难以突破第二次错配。
  2 .可以用减少循环次数来调节AS-PCR的敏感性。我以前曾用过25个Cycle来成功完成AS-PCR。
  
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  非常感谢
  
  bow！！

• @木木@ (2011-9-22 12:11:35)

  1. 可以在引物3‘端倒数第3或4碱基处再设置一个错配碱基，这样就形成了两道gate，即使引物因为冲破第一次错配而扩增，也难以突破第二次错配。
  2 .可以用减少循环次数来调节AS-PCR的敏感性。我以前曾用过25个Cycle来成功完成AS-PCR。
  
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  仔细又看了一遍您的帖子，发现有一处不妥，请各位高手看看是不是：
  所谓的两道gate，我觉得不对。引物的3'末端是最重要的，因为其牵涉到延伸时碱基的加入。但是我觉得仅仅最后一个3'碱基是致命重要的，倒数的base没有这种特点。就算有的话，仅仅能解释的也是“结合不够紧密，对延伸步骤有影响”而已。
  
  不知道大家怎么看待这个问题。

• 柠檬籽 (2011-9-22 12:12:12)

  有人做过发paper的研究，倒数的碱基错配确实可以加以利用