求助：两个OD的干粉状引物要怎么稀释备用？

最新回复

• 韩梅梅 (2011-9-22 13:11:26)

  先离心！然后加入适量的水或TE溶解。一般配制成较高浓度的母液（约100μM），保存于-20℃。使用前取出其中一部分用ddH2O配制成10μM或20μM的工作液。
  引物浓度不宜偏高，浓度过高有两个弊端：一是容易形成引物二聚体（primer-dimer），二是当扩增微量靶序列并且起始材料又比较粗时，容易产生非特异性产物。一般说来，用低浓度引物不仅经济，而且反应特异性也较好。一般终浓度用0.25-0.5pM/μl较好。

• one (2011-9-22 13:12:07)

  由于我是新手，想再请教主任几个比较菜的问题，还望您指导：
  1 引物的分子量如何计算？ 比如：AAGCTTTTACCGC的分子量是多少？
  2 OD值  ，1个OD值是不是等于40UG。
  3 质量数，质量数的含义是什么，怎么计算？
  4摩尔数（μmol）和终浓度(pM)和稀释水量（μl）  
  是不是计算稀释引物都要用到以上四点的各个参数？具体的公式是什么呢？
  向您再次致谢！谢谢！

• 韩梅梅 (2011-9-22 13:12:34)

  合成引物的单子上应该有算法：
  1OD=33ug
  1个碱基的分子量=324.5
  （以上为近似值，通常都这样用）
  1条引物的分子量=碱基数*324.5
  质量数=OD*33ug
  摩尔数=质量数/分子量

• 红豆冰 (2011-9-22 13:12:57)

  我补充问一点，先离心的原因是什么？
  
  直接把算好的ddH2O加进去颠倒混匀后不是效果一样么？
  
  另外，我们实验室的好象都习惯在静置4度过夜，这样引物分子能更好的扩散，均匀分布于液体中，个人认为这样也是很有道理的

• 韩梅梅 (2011-9-22 13:14:24)

  因为引物合成后是干粉状的，在运输过程中可能会沾到管壁或管盖上，直接打开有些粉末可能会飘出去，引物的量就减少了。先离心使粉末都到管底，可以避免这种现象的发生。4度过夜也可以，不过一般室温10分钟，吹打混匀即可。

• 阿拉蕾 (2011-9-22 13:14:42)

  先离心,以防打开后粉末飘散出去。然后根据以下公式可计算出所加双蒸水的量
  33nmol/OD×管上所标OD值×100
  是为10pmol/ul浓度的引物溶液,还可以由此推算其它浓度所需的双蒸水量。
  可于－20度保存。

• 大猫 (2011-9-22 13:15:03)

  订引物回来的说明书背面一般都有引物稀释计算的说明的.

• 豆荚 (2011-9-22 13:15:35)

  先离心,以防打开后粉末飘散出去。然后根据以下公式可计算出所加双蒸水的量
  33nmol/OD×管上所标OD值×100
  是为10pmol/ul浓度的引物溶液,还可以由此推算其它浓度所需的双蒸水量。
  可于－20度保存。
  
  计算结果单位不对呀。是估算值吗？

• 阿拉蕾 (2011-9-22 13:16:06)

  先离心,以防打开后粉末飘散出去。然后根据以下公式可计算出所加双蒸水的量
  33nmol/OD×管上所标OD值×100
  是为10pmol/ul浓度的引物溶液,还可以由此推算其它浓度所需的双蒸水量。
  可于－20度保存。
  
  计算结果单位不对呀。是估算值吗？
  
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  给你提供一下我们的计算方法，引物浓度50uM，需加ddH2O的计算公式：
  OD值×33ug×1000000/（50uM×引物分子量），算出的ddH2O体积单位为ul

• 冰激凌小姐 (2011-9-22 13:16:34)

  33乘以OD数再除以分子量再乘以1000即是所需ddH2O的微升数 浓度：10nM。

• 何去何从 (2011-9-22 13:17:02)

  100pmol比较好吧？注意保存多份 防止污染 啊

• @木木@ (2011-9-22 13:17:54)

  最好用DEPC水,用ddH2O有可能被污染,尤其是做RT-PCR!  

• 爆炸头 (2011-9-22 13:18:22)

  根据你需要的浓度，假如你需要终浓度为64PM，那么你用的DEPC水(RNA),或双蒸水（DNA)的量为33xOD值/64x分子量 ，然后乘以10的六次访，就是你要加入的水的微升数！

• 爆炸头 (2011-9-22 13:18:22)

  根据你需要的浓度，假如你需要终浓度为64PM，那么你用的DEPC水(RNA),或双蒸水（DNA)的量为33xOD值/64x分子量 ，然后乘以10的六次访，就是你要加入的水的微升数！

• @花开花落@ (2011-9-22 13:18:42)

  所用的引物最好用灭菌的超纯水稀释，-20度保存，你可以买那些通过减压干燥的引物，最大的优点在于引物以薄膜状紧贴在管底，无需用前离心，很方便。

• mamamiya (2011-9-22 13:19:11)

  引物从公司回来后我们实验室的一般步骤是：
  可先暂放4度冰箱,后稀释成贮存液、工作液。
  贮存液——100pmol/ul；工作液10pmol/ul。
  具体做法如下：
  1、取出引物，5000rmp/min，离心3min。
  2、小心开启离心管，加入Zul灭菌超纯水，涡旋使其溶解，浓度为100pmol/ul
  Z=10000*OD数*33/引物分子量
  -20度冰箱贮存。
  3、取20ul的100pmol/ul贮存液，加180ul灭菌超纯水，稀释成10pmol/ul，4度冰箱备用。

• 邓布利多 (2011-9-22 13:19:34)

  请问引物的工作液（10uM）可以在四度放多长时间？