我的克隆为什么老是做不出来？

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• @花开花落@ (2011-9-22 14:55:04)

  可能是你PCR产物的酶切位点前保护碱基数目不够。

• 眼药水~ (2011-9-22 14:55:38)

  主任的意思是不是说有可能是我的pcr产物没切开。前几天我做的，载体切过以后，切胶回收纯化，为了检查有没有完全切开，我做了一次转化，结果一个克隆都没长，这就证明完全切开了，拿这次的载体做连接，转化，结果只长了一个克隆，摇菌提质粒结果比原载体还要小，这肯定是不对了。我也怀疑过是不是pcr没切开，但因为切下来的片断太小没办法鉴定。连接估计是不会有问题的，估计pcr没切开的可能性比较大，谢谢主任，我明天再和带我的老师讨论讨论。  

• babybabe (2011-9-22 14:59:32)

  不知道你选的什么酶切位点，怎么会明知切开了，还有可能长的密密麻麻都是？
  
  不会是同尾酶吧！

• 萌芽 (2011-9-22 14:59:56)

  先连接t载体，看看酶切位点有问题吗？

• 萌芽 (2011-9-22 14:59:56)

  先连接t载体，看看酶切位点有问题吗？

• 眼药水~ (2011-9-22 15:00:31)

  那次载体是完全切开了，做连接后只长出了一个克隆，挑了以后提质粒，质粒大小比原载体还要小，会不会是载体发生了自连。如果是酶切位点有问题，那可能性比较大的是pcr产物的酶切位点有问题，明天问问老师。  

• 丁香@@ (2011-9-22 15:01:03)

  做克隆最重要的就是两点：一是连接。目的DNA与载体DNA的比例一定要掌握得当，否则连接效率很低。一般是3：1左右（摩尔比）。你可以调整二者的比例，试一试。二是转化。现在通用的转化方法有两种：电转化和热击法。电转化所用的仪器最著名的是Bio-RAD和GIBCO两个公司生产的电击转化仪。前者一次只能作一个样品。后者一次能作四个。我的经验是后者要好用。热击法是传统的方法。一般来说，对于小片段DNA，两种方法转化效率差别不是很大。但是对于大片段DNA（大于1kb）电击的转化效率明显高于热击。建议你采用电击试试。
  
  还有就是你的感受态不知道作的怎样？感受态也很关键。你可以用一现成的质粒转化你的感受态，检查其转化效率。

• 眼药水~ (2011-9-22 15:01:43)

  问老师了，他说酶切位点没问题，保护碱基在设计时就已经考虑了。感受态是我们科里实验员做的，科里的人都在用应该也没问题。今天又切了一次载体，再做一次看看，谢谢楼上的提醒！  

• 胖小妮子 (2011-9-22 15:02:07)

  我的实验前一段也出了这样的问题，怎么看设计都没有问题，做了四五次，就是连不上。同样的连接酶，载体，做别的都行，就做PCR产物连接不行。后来PFU做PCR后加TAQ延伸，连到T载体上就行了。如果楼主实在试不出来，不如试试这个办法。

• DNA (2011-9-22 15:02:31)

  首先要保证载体要完全酶切开！
  PCR产物应该是很好酶切的，应该不会有太大的 问题。

• 眼药水~ (2011-9-22 15:05:37)

  有一次载体是完全切开了，但仍然是做不出来。

• guagua (2011-9-22 15:33:14)

  偶们也遇到过这个问题，当时发现的原因是因为酶活性不够，没有切开，造成载体都是自成环