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各位高手：遇到这种神奇的问题该怎么办？

字体: 小 中 大 | 打印 发表于: 2011-9-22 17:19    作者: 明天的明天    来源: 分析测试百科网

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各位高手：遇到这种神奇的问题该怎么办？
各位高手：遇到这种神奇的问题该怎么办？ [转载]


事情是这样的：
我从组织中提取目的基因，逆转录后以同一模版做了PCR（第一次PCR），应用了阳性对照。beta actin非常亮很好；
目的基因有了好几条带，根据MARK对比也在相应片段左右出现了很弱条带。
1、切胶，冻存一夜。次日取上清当作模版，PCR，无任何条带出现。
2、用第一次PCR产物电泳，得到那条很弱的条带，切胶，用凝胶回收试剂盒回收，之后PCR，还是没有任何条带出现。
（每次PCR的温度、时间都是相同的。）

请问：1、第一次PCR得到的那条带是我的目的基因吗？是什么原因导致我回收不了那基因？！
2、遇到这样的事情我该怎么做提取我的目的基因？当然，构建cDNA文库是不现实的。

谢谢大家！
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各位高手：遇到这种神奇的问题该怎么办？

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最新回复

  • 明天的明天 (2011-9-22 17:19:37)

    是不是题目不太新颖啊,要沉下去了呀,没有办法自己顶.求救!

  • 椰子叶子 (2011-9-22 17:20:08)

    事情是这样的：
    我从组织中提取目的基因，逆转录后以同一模版做了PCR（第一次PCR），应用了阳性对照。beta actin非常亮很好；
    目的基因有了好几条带，根据MARK对比也在相应片段左右出现了很弱条带。
    1、切胶，冻存一夜。次日取上清当作模版，PCR，无任何条带出现。
    2、用第一次PCR产物电泳，得到那条很弱的条带，切胶，用凝胶回收试剂盒回收，之后PCR，还是没有任何条带出现。
    （每次PCR的温度、时间都是相同的。）

    请问：1、第一次PCR得到的那条带是我的目的基因吗？是什么原因导致我回收不了那基因？！
    2、遇到这样的事情我该怎么做提取我的目的基因？当然，构建cDNA文库是不现实的。

    谢谢大家！

    =======================================================================================================

    我觉得是目的基因的可能性还是比较大的！
    你说你的电泳结果有几条带，而且目的条带较弱，取上清做模板pcr，这样是不是会有模板不纯的问题，我没有明白你说的上清是什么？！
    条带很弱，弱到用凝胶回收都收不到么，建议你回收后跑个电泳看看是否收到了目的片断！？

  • 菠萝喵 (2011-9-22 17:22:16)

    非特异，改变条件

  • 大猫 (2011-9-22 17:23:14)

    非特异，改变条件

    ====

    同意

  • 明天的明天 (2011-9-22 17:23:56)

    目的基因在该组织中表达的丰度不是很高,我已经试过了好几种组织了,结果都不理想----
    我电泳结果有5条带,这个上清指得是挤冻存胶出来的液体
    用凝胶回收试剂盒回收后,跑电泳什么都没有.
    为什么?为什么呀--------
    是我的目的基因不好提取??
    急----------

    谢谢大家

  • 明天的明天 (2011-9-22 17:24:30)

    非特异改变条件,从哪一个阶段改起?
    从做RT-PCR?
    还是PCR温度时间?
    PCR各种试剂的量?
    迷惑中-------------------------------------

    谢谢哦

  • 嗨皮 (2011-9-22 17:24:51)

    先筛BUFFER吧，实在不行就得改变PCR条件了。因你的产物中可能有非特异带，可以先提高退火温度，延长退火时间，实在不行再看看你的目的片段中GC含量是否很高，如果高的话用SANGON的GC BUFFER扩一下看看。

  • DDD (2011-9-22 17:26:01)

    目的基因在该组织中表达的丰度不是很高,我已经试过了好几种组织了,结果都不理想----
    我电泳结果有5条带,这个上清指得是挤冻存胶出来的液体
    用凝胶回收试剂盒回收后,跑电泳什么都没有.
    为什么?为什么呀--------
    是我的目的基因不好提取??
    急----------

    谢谢大家

    ==============================================================================================================

    我个人认为还是纯化的好，但是你的片断又太弱，回收后的量少到跑胶看不出来，所以还是先改条件重做RT－PCR，至于怎么改我觉得还是自

  • mooon (2011-9-22 17:26:53)

    目的片段弱，特异性也不高，应该考虑用nest-PCR试一试。  

  • mooon (2011-9-22 17:26:53)

    目的片段弱，特异性也不高，应该考虑用nest-PCR试一试。  

  • 明天的明天 (2011-9-22 17:27:12)

    先 筛BUFFER实在不行就得改变PCR条件了。因你的产物中可能有非特异带，可以先提高退火温度，延长退火时间，实在不行再看看你的目的片段中GC含量是否很高，如果高的话用SANGON的GC BUFFER扩一下看看。

    加DMSO行吗?它不也是调和GC比值的嘛,我做50体系的,加DMSO2ml可以吗?
    并且您说的"SANGON的GC BUFFER扩一下看看"是什么意思,我没有看懂,请教给我啊.

    主任:
    我是新手,nest-PCR是一种PCR方法吗?适合什么情况下用?怎么用?
    烦请您百忙之中赐教.

    谢谢!

  • 韩梅梅 (2011-9-22 17:27:42)

    SANGON的GC BUFFER应该是上海生工的GC BUFFER 吧。

    nest-PCR：

    http://www.dxy.cn/bbs/post/view? ... rds=%B3%B2%CA%BDpcr

    http://www.dxy.cn/bbs/post/view? ... =1&ppg=1#520147
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