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【求助】关于细胞爬片做免疫荧光的系列思考与疑惑
【求助】关于细胞爬片做免疫荧光的系列思考与疑惑
我养的是原代内皮细胞，最近将其做细胞爬片，然后做CD31的免疫荧光。遇到的问题是：
1、虽然小盖玻片也经过泡酸、明胶包被等系列处理，但是细胞在玻片上的长势还是不如在塑料上。当塑料上已接近融合时，玻片上还是星星点点的。在消化传代时，皿里的细胞死爬在上面，很难消化下来——不是细胞状态不好吧？
2、最头大的是很多次的掉片问题。玻片上的比塑料上的容易掉。而且，我以为固定以后就不会掉片了，其实不然，在加完二抗后也会掉。就会看见玻片上有一小白点，就知道不妙，放显微镜下一看，细胞找不到了。冲洗我已经很小心了，是加在玻片外面的边上，让水滴就着重力作用滚下来浸过玻片。只有加抗体时是慢慢滴到玻片上的。之后就在塑料皿里直接做，发现掉片是整片的卷起来，就像蜕皮一样。我加液体是加在皿壁上的。
3、既然玻片不好，为什么没有塑料片代替呢？搜了下只有那种很贵的做FISH原位杂交的塑料片，还可以裁剪还已经灭菌好了的，就是太贵了。其他我们平时用的塑料怎么就不行呢？
4、明胶包被，我觉得0.2%已经够了（根据sigma的说明书推算）。是不是在玻片上需要浓度更高些？还是多聚赖氨酸防脱片效果更好？
5、固定方法，我用的是95%酒精。固定剂很多，有用多聚甲醛有用95%酒精。既然95%酒精是最常用的，而且容易获得，多聚甲醛很难溶，配起来费劲，而且只能放2周，为什么还有很多文献用的是多聚甲醛呢？是否它对维持细胞形态更好呢？
6、做免疫荧光中，每步的PBS洗涤，是否一定要严格那么多时间？起先我都用的计时器，后来就马虎了。不知道大家怎么做的
7、细胞在固定后还脱片，不知道这正常不正常
8、关于细胞生长密度多少适合做免疫荧光的问题。一般文献里说是80%左右。我用生长非常密集的细胞做，本以为可以出来满视野的荧光，结果什么都没瞧见。是因为荧光给一层层的细胞挡住了，还是细胞本来就发生变化或者就不是我要的细胞？接触抑制影响细胞抗原的表达吗？
9、为什么细胞达到融合之后就要传代？融合后发生接触抑制细胞停止分裂，但是不会死亡吧？我的细胞长的很密放在那里1-2周，也没什么变化。液体颜色变化很慢。我以为死了，结果加了胰酶，又一个个收缩了，可以传代。那这样，是不是就可以不用冻存了？
10、细胞爬片做免疫荧光，是不是可以不用过氧化氢灭活内源性过氧化物酶？因为后面没有用到DAB显色。
11、观察时，荧光很弱。在我试验室这间的荧光显微镜看得到荧光，而到成像那边的荧光显微镜却看不到荧光。我看了下能看到荧光的镜头是40*，上面写着fluo什么的，这是专看荧光的镜头吗？或者对荧光敏感？我需要拍同一视野的明场，但是发现，看荧光好的镜头看明场细胞立体感很不明显，不如低倍的，而低倍的镜头看不到荧光。很糟糕。
问题太多了，希望能帮帮我，大家能说多少就说多少吧！
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NBA (2015-11-14 17:24:13)
一个一个慢慢回答：
1、虽然小盖玻片也经过泡酸、明胶包被等系列处理，但是细胞在玻片上的长势还是不如在塑料上。当塑料上已接近融合时，玻片上还是星星点点的。在消化传代时，皿里的细胞死爬在上面，很难消化下来——不是细胞状态不好吧？
2、最头大的是很多次的掉片问题。玻片上的比塑料上的容易掉。而且，我以为固定以后就不会掉片了，其实不然，在加完二抗后也会掉。就会看见玻片上有一小白点，就知道不妙，放显微镜下一看，细胞找不到了。冲洗我已经很小心了，是加在玻片外面的边上，让水滴就着重力作用滚下来浸过玻片。只有加抗体时是慢慢滴到玻片上的。之后就在塑料皿里直接做，发现掉片是整片的卷起来，就像蜕皮一样。我加液体是加在皿壁上的。
问题1、2一起回答：明胶包被盖玻片我没试过，但是我用的多聚赖氨酸，很好，没有脱片现象。其实如果盖玻片严格按照纱布蘸洗衣服慢慢搓洗、自来水冲洗、1%稀盐酸浸泡过夜、自来水冲洗、95%乙醇浸泡过夜、蒸馏水洗、烤干、消毒、烤干，再经过0.01%多聚赖氨酸的处理2h~过夜、无菌蒸馏水或PBS洗3遍等工序之后，细胞种在上面是不会脱片的，除非大力冲洗。细胞在玻片上的长势确实要弱于塑料培养皿的长势，但不会有天渊之别，最多就是稍微长得稀疏一点点。对于在爬片上做加液等操作，其实很有讲究，加液时用的tip要剪去一截再使用，加液便可一滴滴地加，不然tip口太小，你再小心，冲出来的水流还是很大的。
3、既然玻片不好，为什么没有塑料片代替呢？搜了下只有那种很贵的做FISH原位杂交的塑料片，还可以裁剪还已经灭菌好了的，就是太贵了。其他我们平时用的塑料怎么就不行呢？
没说不可以，完全可以的，除却一些比较特殊的染色，比如HE染色等工序比较复杂的染色需要将片子从一个染色缸移到另一个染色缸，那么别的操作，比如贴壁细胞免疫组化，我们完全可以把细胞种在96孔板上，不需要进行细胞爬片就可以直接操作，而且可以省抗体，还可以保湿，更可以除却由于爬片所带来的一系列问题。
4、明胶包被，我觉得0.2%已经够了（根据sigma的说明书推算）。是不是在玻片上需要浓度更高些？还是多聚赖氨酸防脱片效果更好？
我只用过多聚赖氨酸，效果很好。
5、固定方法，我用的是95%酒精。固定剂很多，有用多聚甲醛有用95%酒精。既然95%酒精是最常用的，而且容易获得，多聚甲醛很难溶，配起来费劲，而且只能放2周，为什么还有很多文献用的是多聚甲醛呢？是否它对维持细胞形态更好呢？
因为你做的是免疫荧光，所以最好不要用多聚甲醛，因为它会封闭一些抗原结合位点。其实用酒精也是不妥的，因为酒精固定会使细胞发生皱缩，影响一些指标的判断。你可以用冷丙酮固定，固定时间10min，然后自然挥发干就行。另外纠正：多聚甲醛溶解要讲技巧，是用磁力搅拌器加NaOH加热促溶的，保存时间如放4度可以很久，并非只有2周。
6、做免疫荧光中，每步的PBS洗涤，是否一定要严格那么多时间？起先我都用的计时器，后来就马虎了。不知道大家怎么做的
最好都计时，PBS洗涤时，溶质平衡需要一定的时间。
7、细胞在固定后还脱片，不知道这正常不正常
说明防脱片做得不好。
8、关于细胞生长密度多少适合做免疫荧光的问题。一般文献里说是80%左右。我用生长非常密集的细胞做，本以为可以出来满视野的荧光，结果什么都没瞧见。是因为荧光给一层层的细胞挡住了，还是细胞本来就发生变化或者就不是我要的细胞？接触抑制影响细胞抗原的表达吗？
很难说，你为什么不在密度适中时做而非要在很密的时候做呢？
9、为什么细胞达到融合之后就要传代？融合后发生接触抑制细胞停止分裂，但是不会死亡吧？我的细胞长的很密放在那里1-2周，也没什么变化。液体颜色变化很慢。我以为死了，结果加了胰酶，又一个个收缩了，可以传代。那这样，是不是就可以不用冻存了？
细胞发生接触抑制以后生长变得缓慢，你放那么久觉得可以传代，其实细胞状态就不会很好，毕竟时间久了，细胞代谢的产物对细胞自身有影响。细胞冻存是一种留种的做法，如果你觉得有种子细胞了，那可以不用冻存，如果没有还是做好冻存工作，以免将来后悔。
10、细胞爬片做免疫荧光，是不是可以不用过氧化氢灭活内源性过氧化物酶？因为后面没有用到DAB显色。
有2%BSA封闭即可。
11、观察时，荧光很弱。在我试验室这间的荧光显微镜看得到荧光，而到成像那边的荧光显微镜却看不到荧光。我看了下能看到荧光的镜头是40*，上面写着fluo什么的，这是专看荧光的镜头吗？或者对荧光敏感？我需要拍同一视野的明场，但是发现，看荧光好的镜头看明场细胞立体感很不明显，不如低倍的，而低倍的镜头看不到荧光。很糟糕。
这个是你的软件使用问题，电脑上曝光时间设置得多些，比如300ms看不到就往上调，1s、3s甚至8s，这个是曝光调整问题，并非物镜问题。另外立体感这个也可以调的，显微镜上有调立体观察的虹彩，还有焦距要调好，总之能设置的地方多看看，就OK了。
seven7 (2015-11-14 17:24:29)
我还想说的是：
1、我再在玻片的处理上狠下功夫，上一批处理的玻片当时洗涤时可能比较多，干燥后都叠连在一起了，这次少洗一点，力求彻底干净！
2、我是说要是有软塑料片可以放入孔板中的话就好了，像硅胶啊什么的，怎么制造商不想办法开发开发的。在孔板中做有时只用几个孔，其他孔不用也浪费，呵呵，是怕浪费。
3、您说用丙酮固定，但是鉴于我这种情况如果在孔板中做恐怕丙酮不合适。我看到有复方的固定液卖的，不知道效果怎样
4、细胞很密是因为我积蓄已久了，以为它们长的比较旺经得起折腾。而且，我的试剂是后订的。所以，这次我东山再起，重做一批。
5、最后一点，显微镜的荧光不同，我觉得不是软件问题，是一个在镜子下一眼就看到的荧光（不是很亮那种）另一个镜子下冒着冷汗横竖找不到。眼睛找不到，增加曝光时间更找不到，移动一下都要等好久，模模糊糊的。我觉得是显微镜的镜头分辨率或者说放大的倍数不同，（因为是人家的东西，我没敢仔细看)。我想下次我偷偷把我这边的镜头卸下来装那边的镜子上试试（老师知道了会上纲上线的骂）
再说立体感。明场那个镜子看细胞折光性非常的差，要调暗光线，调好微距才见细胞轮廓。不像换个镜头，清晰明了的那种。
NBA (2015-11-14 17:24:46)
2.其他孔不会浪费的，剩下的孔下次要用时，在工作台上紫外线照1小时以上即可，我经常这样做，没污染过。
3.孔板加丙酮没有不合适的。
4.支持~
5.没实地考察你用的显微镜，不好下结论了，你好好再摸索摸索哈~
seven7 (2015-11-14 17:25:01)
相关疾病：
先天性卵巢发育不全综合征
谢谢。
但是关于丙酮的问题我搜了一大堆来反驳你，呵呵
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/actions/archive/post/1879271_1.html')
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/actions/archive/post/3586232_1.html')
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=66&id=4945147&sty=3&keywords=%CB%DC%C1%CF+%B1%FB%CD%AA')
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/actions/archive/post/4944953_1.html')
还有，紫外照板的话半小时是不是已经足够了？
欢迎大家多提意见！
seven7 (2015-11-14 17:25:26)
中毒
关于第9个问题，我搜索了下：
“细胞数量达饱和密度后，细胞遂停止增殖，进入停滞期。此时细胞数量不再增加，故也称平顶期（Plateau）。停滞期细胞虽不增殖，但仍有代谢活动，继而培养液中营养渐趋耗尽，代谢产物积累、pH降低。此时需做分离培养即传代，否则细胞会中毒，发生形态改变，重则从底物脱落死亡，故传代应越早越好。传代过晚（已有中毒迹象）能影响下一代细胞的机能状态。在这种情况下，虽进行了传代，因细胞已受损，需要恢复，至少还要再传1～2两代，通过换液淘汰掉死细胞和使受损轻微的细胞得以恢复后，才能再用。结果反而耽误了时间，这是在实验中应特别注意的。”“凋亡率的增加或许归因于细胞之间的接触抑制”
那么我不解的是，停滞期不增值时的代谢难道要比增殖期消耗的多吗？营养耗尽，PH降低我及时换液就是了。而我那长得满满的细胞，培养基颜色改变不大，不管是什么状态。很奇怪。
还有一个不一致的说法：（都取自文献）
1、“接触抑制会使ECV304细胞对NK细胞杀伤有一定抵抗，同时伴有CD112和CD155分子表达的下调”
2、“故在细胞处于分裂增殖状态时 ,并不表达其表型。当细胞密度高而发生接触时 ,接触抑制作用将发挥效应 ,从而抑制细胞分裂增殖 ,进而启动细胞分化机制 ,细胞始可表达特异的表型 [9 ]。据此原理我们选自第 3代爬满玻片发生接触抑制的细胞进行表型检测”
那么对于非肿瘤细胞，我们一般该在什么时机检测表型呢？
NBA (2015-11-14 17:26:13)
但是关于丙酮的问题我搜了一大堆来反驳你，呵呵
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还有，紫外照板的话半小时是不是已经足够了？
欢迎大家多提意见！
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对哦，忘了是塑料板了，呵呵
Darcy (2015-11-14 17:26:36)
内皮细胞我觉得还是很好消化的，不过似乎大血管和微血管来源的内皮细胞消化时间会有很大差别。微血管耐得住消化，而大血管不行。不知道你养哪一种啊？
我做的是内皮细胞八因子染色，没发现很严重的掉片。你滴加的时候也很小心，也许不是操作的问题，我是用1%的明胶包被玻片，你也可以试一下把明胶的浓度提升一下。
我用多聚甲醛固定的，可能95%酒精也可以吧，不过要是用6孔板的话不能用丙酮，会让玻片粘在板子上取不下来的。
我的内皮细胞生长很缓慢，而且是一个集落一个集落生长的，反正我是没有让它们全部融合80%再做染色，也等不了这么一天，我就是把两个孔里的细胞生长1周后就一起消化下来种在两个玻片上，这样细胞量还是不够，染的细胞不是融合成片的。细胞长得很密很密我倒是没有过，呵呵汗颜~~~准备再做一次。
多多交流~~~
seven7 (2015-11-14 17:26:59)
我的微血管内皮不好消化，一般要分2批，即先让一部分细胞先下来，这时还有部分根本没变形的，再加胰酶再消化。
最近我做了细胞的免疫荧光。是在24孔板上做的。因为玻片，虽然我虔诚地好好泡酸（新配的中强清洁液），好好的冲洗，（镊子夹住流水冲），用明胶或者多聚赖氨酸包被，但是，一加细胞的即刻就看见细胞不愿在玻片上呆，不管我是顺时针晃还是吹打还是十字摇晃，玻片上的就是偏少。即使有的，到第2、3天看细胞很多还是圆的不变形，再往下就死翘翘了。而在塑料上的就是长的好，一天一个样，即使就在玻片的周围。现在我高度怀疑是玻片没有用酒精脱脂所致，但也只有再试了才知道。
stillhorse我看了你的荧光爬片，觉得你细胞密度还是可以的。反正我的细胞3天就要传了。
但是还有个怪现象，但也可能是我少见多怪。
就是，有荧光的细胞在明场下轮廓很淡，没有立体感，就像路面上的水泥坑坑洼一样。光线要开得很暗很暗才能在成像的屏幕上看见，肉眼在镜子里看不见。曾经先在明场下没有找到细胞就以为是掉片了，其实不是！
曾经做过一批，没有做出荧光的那批细胞，明场下很清楚很有立体感，我不知道这是为什么？
这是有荧光的细胞在明场的样子：没有立体感，折光性很差，光线很弱时才能分辨。几乎每个细胞都有荧光。
82006315.jpg
seven7 (2015-11-14 17:27:25)
这是做不出荧光的细胞，立体感很强，很漂亮，但是没有荧光，白搭（我不信我细胞不纯到一个细胞都没荧光的程度）
但我不知道这是为什么！
90065689.jpg
zhy平平 (2015-11-14 17:27:39)
我是实验室主任技师,细胞免疫组化工作我已经做了近十年,看上去你的细胞爬片还是可以的,没发现细胞上有荧光说明你组化没有成功,应该从试剂方面以及你的细胞上是否有CD31受体方面找原因.另外如果操作不当组化也会失败,尤其是荧光很易淬灭.试剂的保存时间、温度、避光方面没注意到也会导致实验失败，如果需要可以到我这里来，我帮你做。
seven7 (2015-11-14 17:27:58)
谢谢楼上的老师。
我现在的问题集中在2个方面（前面我太罗嗦了）：
1、在玻片上细胞生长不良的问题。目前看来，只有增加脱脂这步工作，以及提高包被的浓度。
2、这2张图都是在孔板上做的固定和荧光。试剂是一样的。第一张图能做出荧光来，很漂亮，但是同一视野在明场下细胞立体感很差。而下一张图，细胞很清楚，却做不出荧光来。这之间会有什么差异？
我的猜想是：加triton打孔的效果可能有差异。第一张失去了立体感，因为细胞被通透了的原因。但我不明白，第二张为什么就做不出荧光，想不明白（发帖子，只想弄个明白，而不是只想得到结果）。因为我做的CD31，胞浆胞膜都有表达，即使胞浆没有通透到，胞膜上也应该有荧光的呀？
请大家谈谈自己的经验吧！
sunbent (2015-11-14 17:28:13)
原来大师们在这里，做免疫荧光一定要爬片吗？（太愚钝了，请指教）
ujne (2015-11-14 17:28:56)
内皮细胞我觉得还是很好消化的，不过似乎大血管和微血管来源的内皮细胞消化时间会有很大差别。微血管耐得住消化，而大血管不行。不知道你养哪一种啊？
我做的是内皮细胞八因子染色，没发现很严重的掉片。你滴加的时候也很小心，也许不是操作的问题，我是用1%的明胶包被玻片，你也可以试一下把明胶的浓度提升一下。
我用多聚甲醛固定的，可能95%酒精也可以吧，不过要是用6孔板的话不能用丙酮，会让玻片粘在板子上取不下来的。
我的内皮细胞生长很缓慢，而且是一个集落一个集落生长的，反正我是没有让它们全部融合80%再做染色，也等不了这么一天，我就是把两个孔里的细胞生长1周后就一起消化下来种在两个玻片上，这样细胞量还是不够，染的细胞不是融合成片的。细胞长得很密很密我倒是没有过，呵呵汗颜~~~准备再做一次。
多多交流~~~
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你好！你养的是人脐静脉内皮细胞原代吗？我最近也在养，已经三次了，但都不好，第一次消化时间过长了，都是碎片，第二次长虫子了，第三次有几个成团的细胞，但数量很少，请问你的试剂及实验方法具体是怎样的，谢谢！还有细胞长什么样，我的是圆形的，已经一周了。
seagate (2015-11-14 17:29:21)
但我不知道这是为什么！
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你好，你现在解决了么？我养的是神经细胞，要求悬浮的肿瘤细胞在爬片上贴壁，并且在NGF存在的情况下进行分化，因此在爬片上要养7天之久。我用鼠尾胶包被爬片，多聚赖氨酸试过，根本没有用。但是细胞即便早期贴壁分化良好，到了第六第七天，也都差不多浮起来了，再即便不浮起来，经过洗涤，固定，染色等过程，爬片上的细胞也所剩无几。
不知道问题出在哪里？还是说我这个细胞压根就不适合做爬片？
seven7 (2015-11-14 17:29:47)
不知道问题出在哪里？还是说我这个细胞压根就不适合做爬片？
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悬浮生长的细胞不适宜做爬片
seagate (2015-11-14 17:30:09)
QUOTE:
这个细胞一开始是悬浮细胞，待贴壁后促进其分化后长出轴突就类似于贴壁细胞了。我在细胞培养板上都能培养，但是一到爬片上细胞长到第六七天的样子就贴壁效果很差，甚至部分已经漂浮起来了。
为这事愁死了。
vvmmoy (2015-11-14 17:30:23)
冒昧问问各位前辈，有没有可能公司出售的蛋白质的结构还没有被公开呢？如果我想知道某种蛋白质的空间结构应该去哪里找呢
panda王 (2015-11-14 17:30:48)
QUOTE:
你好，在么？请教下，我用爬片做免疫荧光，选文献报道及抗体说明书中强阳性的细胞来做对照，但是荧光很弱，基本看不出来，dapi倒是很强，能请问下您遇到过这种情况么？【求助】关于细胞爬片做免疫荧光的系列思考与疑惑