【求助】请教关于细胞复苏的问题

最新回复

• nikun230 (2015-11-14 20:38:16)

  
  1、用冰盒转移到实验室（约10分钟）。
  你应该在从液氮中取出细胞前就准备好37度的水浴，取出后马上放入。
  2、融化后取出，未离心，将液体转移至培养瓶中。
  这是非常严重的错误！冻存液对细胞有毒性，解冻后必须用Dhanks洗两遍才能移入培养瓶中培养。培养液中血清不能太少。

• yueban-1147 (2015-11-14 20:38:36)

  
  细胞复苏后的效果好坏也跟冻存过程及冻存前细胞的长势有关，也许不全是你操作的问题。
  我们从液氮拿出来，以最快速度丢入37度水浴，等细胞液刚刚化完取出，加培养液稀释。这样可以避免复苏过程中细胞液中有冰晶的出现，冰晶会破坏细胞膜及细胞内部结构的。还有，细胞若要长得好，还要维持一定的密度，再好的细胞如果复苏后选用的培养液体积太大，细胞密度太低，也长不好。
  仅供参考。

• 子衿青青 (2015-11-14 20:39:05)

  
  还有一点要注意的是，冻存液转到离心管后加培养基最初的几滴要边加边摇以免渗透压改变太快使细胞破裂。
  我们用的冻存液是9份血清加一份DMSO混合成的。
  细胞冻存时冻存液中的细胞密度不能太低，因为复苏时细胞会死掉一部分。

• baidukk (2015-11-14 20:39:29)

  看看这里的帖子，也许有帮助啊
  cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=67&id=447750&sty=3&keywords=%CF%B8%B0%FB%B6%B3%B4%E6')

• leifengta (2015-11-14 20:40:04)

  
  2、融化后取出，未离心，将液体转移至培养瓶中。
  这是非常严重的错误！冻存液对细胞有毒性，解冻后必须用Dhanks洗两遍才能移入培养瓶中培养。培养液中血清不能太少。
  我觉得并不是这样，我们一般采用冰箱中取出后立即放入37度水浴，融化后立即加入培养液。培养4-5个小时后，换液，除去死细胞，继续培养。我对比过比反复离心洗细胞的成活率高得多。（冻存液是9份血清加一份DMSO）
  个人认为这样反复离心会使脆弱的细胞死亡率大大增加。但是必须当天换液否则会对细胞生长产生很大影响。

• bananapeople (2015-11-14 20:40:51)

  
  相关疾病：
  先天性卵巢发育不全综合征
  1.细胞冻存时的状态要好，冻存的速度要快，我每次在加好冻存液后，1分钟之内放入液氮罐的气层，4小时后放入液氮。
  2.复苏的速度也要快（装有10MlPBS的离心管，离心机设定，培养液都要事先准备好）。我每次将冻存管取出，立刻放入40度左右的水中，在超净台中用已准备好的PBS吹打使其快速融化，然后离心，一般也在1－2分钟内完成。第二天一定要换液，细胞贴壁后可以摇一摇，完全倒掉液体，还新的液体。如未贴壁可用400－800低速离心。这样作我每次的细胞复苏，4－5天状态都会很好
  3.原因：冻存液对细胞有一定毒性，所以动作要快，要洗。
  0－5度时细胞容易被破坏，所以一定要使其最快度过这一温度，但不能用超过45度的水，对细胞的损害也很大。

• jiushikeshui371 (2015-11-14 20:41:10)

  我觉得冻存地时候应该缓慢一些，否则会形成冰晶，对细胞有很大伤害，有条件地话应该采用程序降温，每分钟1-2度，条件限制我们采用4度30分钟，-20度一个小时然后转入－70冰箱或者液氮。
  关于复苏的问题，我做过实验。同一批冻存的细胞，我开始采用复苏后离心去冻存液的方法，死伤无数，复苏没有成功！然后我采用直接培养，短时间内换液的方法，成活率非常高。不过我们的细胞是冻存在-70度冰箱里，液氮的没有试过。

• bananapeople (2015-11-14 20:41:50)

  1.细胞冻存时的状态要好，冻存的速度要快，我每次在加好冻存液后，1分钟之内放入液氮罐的气层，4小时后放入液氮。
  2.复苏的速度也要快（装有10MlPBS的离心管，离心机设定，培养液都要事先准备好）。我每次将冻存管取出，立刻放入40度左右的水中，在超净台中用已准备好的PBS吹打使其快速融化，然后离心，一般也在1－2分钟内完成。第二天一定要换液，细胞贴壁后可以摇一摇，完全倒掉液体，还新的液体。如未贴壁可用400－800低速离心。这样作我每次的细胞复苏，4－5天状态都会很好
  3.原因：冻存液对细胞有一定毒性，所以动作要快，要洗。
  0－5度时细胞容易被破坏，所以一定要使其最快度过这一温度，但不能用超过45度的水，对细胞的损害也很大。
  ......
  我不同意你地一点的看法，我认为应该是缓冻速溶，冻存的时候速度不要太快，因为太快可是董存液体组织在细胞膜外，达不到冻存效果。可先防盗-20一小时，在-80度一小时，在转到液氮中。
  另外第二点也不同一个地方是：第二天的液体不必再换。因为剩下的dmso对于细胞来讲，完全不是毒性的水平，而是促细胞生长的水平。DMSO很低水平是粗细胞生长的。
  另外，细胞刚副出来，还很脆弱，在离心可能会造成他们的损伤，以外刚建立的生长环境被破坏，比如一些细胞银子也被焕夜时除掉了。
  另外，副细胞时候，刚刚加入培养也时候，一定要慢慢加入，且贴管壁加入，这样可以最大限度的保护细胞。

• ukonptp (2015-11-14 20:42:12)

  
  cuturl('http://www.eginkgo.com/yaoxue/yx_12.htm')
  Big Smile 看看这个银杏内酯对NaCN及缺糖引起的PC12细胞凋亡的保护作用对你有用吗???

• ending (2015-11-14 20:52:38)

  
  我同意取出后立即放入37℃和离心除去冻存液，我们以前也是这样做到，每次都能成功复苏。而且我们的细胞有些已经冻存了一年多了，照样能复苏的。再试试吧。

• baidukk (2015-11-14 20:53:16)

  
  1.取出冷冻管应立即放入37℃水槽中快速解冻,轻摇冷冻管使其在1分钟内全部融化,否则冰晶形成会破坏细胞膜和细胞内部结构,就有可能形成你所说的细胞碎片.
  2.目前使用的冷冻保护剂一般有两种:一种是渗透性保护剂,如DMSO等可渗入细胞内使水分大量溢出细胞;一种是非渗透性试剂,如Dextran等,在细胞外形成高渗,使细胞脱水,从而保护细胞不受冰晶的损伤.
  3.DMSO常温下对组织细胞有毒性,须尽可能减少其回输量,单用DMSO一方面对细胞有毒性,另方面需DMSO量大,成本较高,故考虑合用DMSO和非渗透性保护剂.
  4.解冻后是否要立即去除冷冻保护剂,依细胞而异,你所养的是PA317,这种细胞不需要立即去除冷冻保护剂,在解冻数日后更换培养基就可以了.
  以上意见仅供参考,祝你成功!

• dmg (2015-11-14 20:53:34)

  
  cuturl('http://wenku.baidu.com/view/944ea2c3f524ccbff12184b9.html') 你可以参考这里，细胞的复苏，冻存