查看完整版本请点击这里：
【转帖】细胞复苏经验总结
【转帖】细胞复苏经验总结
相关疾病：
痛风
细胞复苏是一简单的试验操作，但操作中有许多需要注意的事项，在实验操作中注意细小问题，才能使复苏后的细胞状态保持良好。现将细胞复苏的操作程序和注意事项总结如下。
【操作程序】
1. 细胞实验室进行常规消毒，紫外照射30 min以上，超净台开启通风10 min。
2. 将新鲜培养基置于37℃恒温水浴锅中回温，回温后喷以70 % 酒精并擦拭，移入无菌操作台内。将10 ml左右新鲜培养基移入无菌细胞培养瓶中，备用。
3. 从液氮保存罐中取出冻存管，立即放入40℃水浴中，轻摇冷冻管使其在快速全部融化，以70 % 酒精擦拭冻存管外部，移入无菌操作台内。
4. 将细胞悬液移入已加培养基的细胞培养瓶中，放CO2培养箱中培养。
5. 待细胞贴壁后（根据细胞种类贴壁时间不同，一般4小时左右），弃去含有冷冻保护剂的培养基，加入新鲜培养基继续培养。
【注意事项】
1. 取细胞的过程中注意带好防冻手套，护目镜。细胞冻存管可能漏入液氮，解冻时冻存管中的气温急剧上升，可导致爆炸。
2. 常温下二甲基亚砜（DMSO）对细胞的毒副作用较大，因此，必须在1-2 min内使冻存液完全融化。如果复苏温度太低，会造成细胞的损伤，所以选择40℃复苏。
3. 贴壁细胞复苏实验标准流程是将解冻后的细胞悬液先进行离心，以去除冷冻保护液DMSO对细胞的损伤，但是离心也会对刚复苏的状态欠佳的细胞产生损伤。也有的实验操作是将解冻后的细胞悬液先直接吹打均匀后分装到培养瓶中进行培养，第二天换液。这可能使培养基中少量的DMSO对细胞造成损伤。
查看完整版本请点击这里：
【转帖】细胞复苏经验总结
【转帖】细胞复苏经验总结
最新回复
lyxsqs (2015-11-14 20:56:50)
1.可以提前把需要的体积的培养液放到培养瓶里，拧松瓶盖，放到孵箱里半小时到1小时，这样温度和ph值都已经最适合细胞生长了。
2.为防止冻存管在升温时爆裂等，可以在放入水浴前就实现在超净台里把盖子拧松一下然后再拧上。从液氮罐里拿出来不是说一定要分秒必争地放入水浴。细胞从液氮的零下1百多度升到比如负八十这个过程对细胞没有损害。有足够的时间handle这些。只不过一旦细胞化了，就应该争分夺秒地把它放入培养液了，主要是为了稀释DMSO。常温下高浓度DMSO对细胞的损害比较大。
3.水浴温度40C应该也没问题，但正规的protocol上从来都只说37C。反正应该相差不大，但不能太高了。另外，不必等细胞全化了再从水浴里取出来。只要冰块浮起来了就差不多了。我一般最多水浴不超过1.5分钟。然后经过喷酒精消毒什么的差不多又半分钟过去了。每次都还有没化的。先把已经融解的部分吸到培养瓶里，再从培养瓶里吸些培养液到冻存管里，余下的冰块瞬间就化了，再一起吸到培养瓶里。
zbboom (2015-11-14 20:57:19)
我觉的楼上的观点挺正确的！我就是这么做的！
remonte (2015-11-14 20:57:38)
我们实验室就是从低温冰箱取出冻存管，37°水浴快速溶解，然后离心，弃冻存液，进超净工作台加入1毫升培养液，吹打，转至培养瓶，再加4毫升培养液，培养箱中养起，第二天换液。一直都这样，细胞长的也好。
chengjie79 (2015-11-14 20:58:03)
yyaxw84 (2015-11-14 20:58:23)
有时候,在液氮中冻存了很多种细胞,复苏的时候可能会将许多细胞取出来,捡出需要的细胞时,最好用泡沫盒盛上一些液氮,将细胞放在泡沫盒的液氮里,慢慢找你想要的(对于细胞这玩艺,还是能快就快哈),这样对细胞的影响最小,你也不会手忙脚乱了。
宁小胡 (2015-11-14 20:58:50)
===============================================================================================
我们是取出冻存管，37°水浴快速溶解，然后加入3ml左右的培养液，离心，弃上清，加5ml培养液，转至培养瓶，第二天换液。
sistis (2015-11-14 20:59:12)
我们也是要离心后加培养液，要不试试楼主的啦
tewank (2015-11-14 20:59:39)
恩，我们是37度水浴，尽快稀释到10倍左右培养基中，离心后，重悬，再转至培养瓶里的
11_hjx (2015-11-14 21:00:12)
其实离心对细胞的伤害和DMSO对细胞的伤害基本差不多，哪个方便用哪个
吉吉0120 (2015-11-14 21:00:37)
至于说到底离心好呢，还是不离心第二天换液的问题，我想说的是。这应该根据你细胞的具体情况定，有时候细胞储存候状态不是太好，是时候就不需要离心，直接第二天换液最好，因为离心对细胞也算是一种损伤。反之，如果细胞状态好，则离心。
最后我建议复苏的时候一管离心，一管不离心培养，这样比较好比较。
dreaming (2015-11-14 21:00:53)
我是按照大家的步骤操作的，可是细胞不贴壁，复苏了几次了都这样。怎么这样啊？
lorri (2015-11-14 21:04:49)
11_hjx (2015-11-14 21:05:12)
有用，楼主辛苦了！我是新手，一般还是按照标准流程来，及快速解冻后，离心，弃去含DMSO的冷冻保护剂，再加培养基！
wanglaoshi (2015-11-14 21:06:12)
有用，楼主辛苦了！我是新手，一般还是按照标准流程来，及快速解冻后，离心，弃去含DMSO的冷冻保护剂，再加培养基！
dmg (2015-11-14 21:07:39)
细胞复苏时应在短时间内尽快全融化，特别是在-5--0度这个阶段，以保证细胞外晶体尽快融化，避免慢速融化水分渗入细胞再次形成胞内晶体损伤细胞。关于离心去除DMSO或甘油应该根据具体细胞具体对待。
quiqui008 (2015-11-14 21:08:03)
2.为防止冻存管在升温时爆裂等，可以在放入水浴前就实现在超净台里把盖子拧松一下然后再拧上。从液氮罐里拿出来不是说一定要分秒必争地放入水浴。细胞从液氮的零下1百多度升到比如负八十这个过程对细胞没有损害。有足够的时间handle这些。只不过一旦细胞化了，就应该争分夺秒地把它放入培养液了，主要是为了稀释DMSO。常温下高浓度DMSO对细胞的损害比较大。
3.水浴温度40C应该也没问题，但正规的protocol上从来都只说37C。反正应该相差不大，但不能太高了。另外，不必等细胞全化了再从水浴里取出来。只要冰块浮起来了就差不多了。我一般最多水浴不超过1.5分钟。然后经过喷酒精消毒什么的差不多又半分钟过去了。每次都还有没化的。先把已经融解的部分吸到培养瓶里，再从培养瓶里吸些培养液到冻存管里，余下的冰块瞬间就化了，再一起吸到培养瓶里。
......
===========================================================================
我觉得这个方法挺好的，因为我也是觉得在1~2分钟内，水浴根本就解冻不完，你的方法很值得借鉴~
yapuyapu (2015-11-14 21:12:45)
2.为防止冻存管在升温时爆裂等，可以在放入水浴前就实现在超净台里把盖子拧松一下然后再拧上。从液氮罐里拿出来不是说一定要分秒必争地放入水浴。细胞从液氮的零下1百多度升到比如负八十这个过程对细胞没有损害。有足够的时间handle这些。只不过一旦细胞化了，就应该争分夺秒地把它放入培养液了，主要是为了稀释DMSO。常温下高浓度DMSO对细胞的损害比较大。
3.水浴温度40C应该也没问题，但正规的protocol上从来都只说37C。反正应该相差不大，但不能太高了。另外，不必等细胞全化了再从水浴里取出来。只要冰块浮起来了就差不多了。我一般最多水浴不超过1.5分钟。然后经过喷酒精消毒什么的差不多又半分钟过去了。每次都还有没化的。先把已经融解的部分吸到培养瓶里，再从培养瓶里吸些培养液到冻存管里，余下的冰块瞬间就化了，再一起吸到培养瓶里。
......
================================
恩呀 相同的操作方法 觉得如此比较顺
daod (2015-11-14 21:13:37)
我直接37度热激完了培养，第二天换液，发现细胞死得比较多，以前热激完了，离心后加培养基血清培养，倒是死细胞会少一些，可能高温下DMSO对细胞的损伤要大些，建议离心好些
bring (2015-11-14 21:15:26)
2.为防止冻存管在升温时爆裂等，可以在放入水浴前就实现在超净台里把盖子拧松一下然后再拧上。从液氮罐里拿出来不是说一定要分秒必争地放入水浴。细胞从液氮的零下1百多度升到比如负八十这个过程对细胞没有损害。有足够的时间handle这些。只不过一旦细胞化了，就应该争分夺秒地把它放入培养液了，主要是为了稀释DMSO。常温下高浓度DMSO对细胞的损害比较大。
3.水浴温度40C应该也没问题，但正规的protocol上从来都只说37C。反正应该相差不大，但不能太高了。另外，不必等细胞全化了再从水浴里取出来。只要冰块浮起来了就差不多了。我一般最多水浴不超过1.5分钟。然后经过喷酒精消毒什么的差不多又半分钟过去了。每次都还有没化的。先把已经融解的部分吸到培养瓶里，再从培养瓶里吸些培养液到冻存管里，余下的冰块瞬间就化了，再一起吸到培养瓶里。
......
=======================================================
但是您在把培养瓶里面的培养液转移至冻存管的过程中，很容易污染啊
dreaming (2015-11-14 21:15:45)
对于细胞长菌这种事。。。排除操作因素以外，其他就是人品了。。。
话说怎么防止冻存管爆炸昂？
【转帖】细胞复苏经验总结