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【求助】我做的同一条带的二次电泳结果。
我的样品加不含巯基乙醇的buffer处理,不煮,直接上百分之九的SDS PAGE胶,【求助】我做的同一条带的二次电泳结果。
考染,目的条带大约180kd。
然后我切下目的条带,塞到另一块胶的上样孔,条带依然水平,同时做两个。一个加含巯基乙醇的loading buffer,另一个加不含巯基乙醇的,但是含SDS的loading buffer,放置20min,然后正常电压电泳,银染。
第二次电泳后,180ka的带消失,出现四条带,除了最大的90kd的那条带,剩下的三条在我重复实验中都有。 样品最开始要跑出切下的胶条,marker不用,这个误差不大,我同时切了前一次marker的90kd的带,也做了二次电泳,迁移率相差不大。
有两个问题想请教:
1:180kd的蛋白,跑出来的这三四条不同大小的带,是不是能表明它是异源多聚体?
2:第一次电泳的上样buffer是不加巯基乙醇,跑出是180kd,为什么第二次胶条也是同样的buffer处理,却跑出小分子量蛋白条带?
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最新回复
wwwh (2015-11-15 11:28:09)
我把含有杂蛋白的组分先非还原处理,电泳,然后洗脱复性,底物检测能知道那条带是我要的蛋白。
然后把我要的蛋白条带切下,还原处理,是想看它的亚基构成,然后做N端测序,或者质谱
p1900 (2015-11-15 11:28:30)
xiaoxiaojinglin (2015-11-15 11:28:49)
180kd的条带感觉像是一个蛋白复合物,你在进行第二向电泳的时候,由于加入巯基乙醇与否,并不影响蛋白的分离,表明180kd的蛋白不是通过二硫键维系的多亚基蛋白,而仅仅是一个通过非共价键维系的蛋白复合物。
第二向电泳跑出多组分是不是由于你(在裂解液或page胶)加入了SDS的缘故?
小妖精@ (2015-11-15 11:29:09)
所以后来真个过程都放弃硫酸铵沉淀。 纯化过程中没有试过硫酸铵沉淀,以后可以摸索下条件。
请问你当初是怎么想到要在疏水后再沉淀? 还有沉淀的是杂蛋白吗?沉淀后再上样,上的是什么柱子,还是直接跑胶?
PP熊 (2015-11-15 11:29:33)
我的第一次和第二次都有在loading buffer和page胶中加SDS,为什么第一次是189kd,第二次就分出了多组分,这个是我一直弄不明白的。
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