【求助】荧光定量PCR标准品制备问题

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• DDD (2015-12-04 15:29:29)

  
  思路上是对头的。但是技术上存在很大隐患。之所以要“标准品的片段要比目的片段稍长”是要避免二轮PCR时（荧光定量PCR时）扩增的失败。你的这种设计实质上是要跑一个巢式PCR。巢式PCR成功的最大技巧在于尽可能设计不同的两轮引物， 至少要有1条引物的不同（半巢式）。同一对引物用于两轮也有成功的可能，但在二轮扩增时要严格控制一轮产物的量，否则很容易产生涂抹带。这对于你必须做标准品浓度梯度显然是不现实的。建议在荧光定量PCR引物外侧再设计一对引物，用来产生标准品。否则很可能花的每一分钱都不能产生效益。

• bgf5 (2015-12-04 15:30:16)

  我也知道这样效果可能不理想的。但是关于引物设计，存在一些问题。很担心再设计出来的引物特异性不够。

• vera+ (2015-12-04 15:30:35)

  
  我用同样的引物试过，可以做梯度的。不过具体情况不同可能有差异。你可以先试试，反正引物是现成的，效果不好再另外合成引物。

• summerxx (2015-12-04 15:30:56)

  
  建议你将扩增序列插入T载体后作为标准品，这样做有如下好处：
  1，标准品便于制备。提纯质粒产量很高，做绝对定量时一个反应的标准线用不到1ng载体。
  2，标准品可重复性强。使用PCR扩增产物作为标准品，难以保证其降解发生（如DNA酶等）；提纯载体时可以有效去除降解因素，并能够保存很长时间。
  3，定量准确。载体的分子量已知，因而其对应模板量可以计算得出，较PCR扩增片段定量准确很多。
  先说这么多吧，我实验室已经长期使用载体做标准品，还是很稳定的。

• summerxx (2015-12-04 15:31:32)

  我也知道这样效果可能不理想的。但是关于引物设计，存在一些问题。很担心再设计出来的引物特异性不够。
  
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  二轮引物设计相对容易。因为模板是一轮产物，复杂程度降低了很多。夸张点说，就算你在一轮产物两侧随意拉出两条Tm值接近的引物，实验成功的几率都有8，9成。

• yizhi (2015-12-04 15:31:55)

  我同意：二轮引物设计相对容易。

• bgf5 (2015-12-04 15:32:18)

  嗯，谢谢各位的建议。先做做预实验看看，不行再考虑其他办法。

• dotaaa (2015-12-04 15:33:09)

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  强烈建议楼主接受大家的建议,将以上两位站友的建议综合起来,即设计一对外围引物扩增PCR,将产物连入T载体,获得标准品的质粒,这样做的优点楼上已经说得很清楚了.用PCR产物作为标准品会遇到很多头疼的问题,本人曾深受其害,比如容易污染啊,容易降解啊,标准曲线相关系数不达标准啊,两次实验的重复性差啊,等等.后来学乖了,制作质粒标准品,一了百了,省去了大量反复实验的时间,所以强烈建议不用PCR产物做为标准品.

• dotaaa (2015-12-04 15:33:28)

  另外,不用担心引物特异性问题,对于这对外围引物来说,要求不高,只要能扩增出我们想要的目的片段即可,有非特异扩增没关系的，我们割胶不就可以了.
  如果经费问题,那么可以如楼上所提到的用有1条引物的不同（半巢式）,也可以的.一条引物的合成费用应该不成问题的.

• IAM007 (2015-12-04 15:34:06)

  不知道楼上是不是做出了理想的结果，就我的实验经验来看，普通的和定量的PCR完全可以用同一对引物，但是对引物的要求就是最好是扩增片段在100BP左右的，这样才能保证定量PCR的顺利进行。
  在标准品制备的过程，我本人也没有进行质粒的转染，只是普通PCR2%琼脂糖凝胶电泳的切胶纯化，效果还是不错的，跑的标准曲线还算漂亮。
  希望这些对你有些启示，不过每个人的实验不一样也许方法需要变通。^_^