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• 33号 (2015-12-11 16:00:00)

  
  回答
  1.rpmi1640培养基
  2.FCS 10%
  3.三蒸水效果更好些，-20度保存
  4.GM CSF 50 ng/ mL, IL-4 10 ng/mL, TNF-α 20 ng/mL

• zbboom (2015-12-11 16:00:23)

  
  谢谢，另外想问：
  1，你们接种单个核的时候是以什么密度接种，
  2，培养器材一般用6孔板还是培养瓶，
  3，细胞因子是先加培养基中还是换液时单独用微量枪加，
  4 诱导培养DC过程中有什么需要特别注意的地方？
  谢谢！

• zbboom (2015-12-11 16:00:51)

  
  还有一点，你们用这种方法培养的得率多高？作成熟和不成熟得表型如何？
  谢谢！

• 33号 (2015-12-11 16:01:13)

  
  1.收集单个核细胞.调节细胞浓度为106/mL,
  2.然后在6孔板上贴壁,每孔加2mL,孔板对细胞吸附性好些
  33h后吸去悬浮细胞,并用37℃预温新鲜培养液轻轻洗去未贴壁的细胞，
  4.用枪使用不同的枪头分别加入细胞因子
  5.主要是熟练操作，无菌观念和规范的操作，一个小的细节能影响全局
  DC获得率（％）约为9%
  DC纯度（％）约为80%
  成熟所需时间7-9天
  成熟表形CD83 90%,CD40 40%, HLADR90%,CD80 85%,CD86 85%.

• zbboom (2015-12-11 16:01:35)

  谢谢！让我对培养又清晰了很多。
  还有几个问题不明白
  1用枪补加细胞因子的话不是每次加后都要混匀一下培养基吗，这样不是更影响下面生长的细胞？好像细胞动它越少，它会长的越好。
  2你们是几天半换量，每次都要补充GM CSF 50 ng/ mL, IL-4 10 ng/mL, TNF-α 20 ng/mL 吗？每次吸出一毫升培养基又不影响下面逐渐漂浮起来的细胞会不会觉得有难度？
  3第几天开始加TNF-α ，促成熟只加这一种细胞因子就够了吗，还是要再加其他一些因子比如IL-6,LPS？
  谢谢！

• zbboom (2015-12-11 16:56:42)

  
  另外刚看了你回别人的如何配细胞因子的帖子，又想到了一个问题
  4，用一般离心EP管的小离心机。装有粉末细胞因子的试剂管离心多少转几分钟?
  谢谢！

• zbboom (2015-12-11 16:57:15)

  高速短暂离心

• whitesheep (2015-12-11 16:58:55)

  我也是做DC和imDC培养的，看了你们的帖子，受益非浅！能否给给你们的电话或邮箱，以便我能和你们交流

• whitesheep (2015-12-11 17:01:33)

  
  请问GM CSF 50 IL-4 用的是ng还是ug，怎么有的文献是ng有的是ug,而且剂量都不一样。请多指教

• zbboom (2015-12-11 17:01:58)

  
  单位统一：ng/ul
  ug/l

• zbboom (2015-12-11 17:02:25)

  让我对培养又清晰了很多。
  还有几个问题不明白
  1用枪补加细胞因子的话不是每次加后都要混匀一下培养基吗，这样不是更影响下面生长的细胞？好像细胞动它越少，它会长的越好。
  2你们是几天半换量，每次都要补充GM CSF 50 ng/ mL, IL-4 10 ng/mL, TNF-α 20 ng/mL 吗？每次吸出一毫升培养基又不影响下面逐渐漂浮起来的细胞会不会觉得有难度？
  3第几天开始加TNF-α ，加几天能成熟，促成熟只加这一种细胞因子就够了吗，还是要再加其他一些因子比如IL-6,LPS？
  谢谢！

• zbboom (2015-12-11 17:03:09)

  
  1.培养液的更换有半量和全量，细胞因子加到新的培养液中，然后再平均加入孔板或培养瓶中。更换培养液很重要，更有利细胞生长。
  2.DC有不同的来源所以一些细节不一样，一般1、3、5、7隔天换，每次都要补充GM CSF 50 ng/ mL, IL-4 10 ng/mL, 在收获细胞前一天添加GM CSF 50 ng/ mL, IL-4 10 ng/mL, TNF-α 20 ng/mL ，
  3.如果悬浮的活细胞比较多的话，可以考虑收集上清，然后离心，保留这些细胞
  4.至于il-6和LPS，各个实验室都有自己的习惯，所以还要看具体的细胞类型

• eor (2015-12-11 17:10:14)

  
  你好！请问培养成熟和未成熟的树突细胞细胞因子的浓度各是多少，谢谢！！

• eor (2015-12-11 17:12:02)

  
  我用的是IL-10培养不成熟的树突细胞。

• eor (2015-12-11 17:12:27)

  
  还有细胞因子有的用的是UL/ML，有的ng/ml怎么换算？谢谢

• eor (2015-12-11 17:12:53)

  再向你请教：如何从大鼠骨髓中分离出DC的前体细胞。能告诉我具体的步骤吗？因为不同文献的方法各不相同，不知道以哪个的为准！

• zhenxin (2015-12-11 17:13:26)

  您好，您的意思是只要在收集细胞的前一天开始加一次TNF-α 20 ng/mL 第二天就能收集成熟的DCs吗，我最后的目的是想取iDC和mDC，让它们分别与NK共培养，看其对NK的影响。

• zhenxin (2015-12-11 17:14:23)

  您好，再次向您请教。
  您的意思是只要在收集细胞的前一天只加一次TNF-α 20 ng/mL 第二天就能收集成熟的DCs，而不用连续加几天吗？我最后的目的是想取iDC和mDC，让它们分别与NK共培养，看其对NK的影响。
  我现在用的是人外周血单核细胞来源得。
  谢谢！

• zhenxin (2015-12-11 17:15:49)

  
  1. iMDC 的诱导方法很多，常用il-10浓度0.2 mg/L
  2.GM-csf刺激单核细胞生长，集落增多，il-4促进B细胞的裂解，TNF-α 促进DC的成熟

• Darcy (2015-12-11 17:16:09)

  请问有谁做过 将分出的单个核细胞诱导为不成熟的CTL 啊?