【求助】贴壁细胞跑western前的准备

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• XYZQ (2015-12-12 22:15:23)

  
  PBS洗后加裂解液裂解，用刮匙刮下细胞，如果裂解不够充分可用超声粉碎，12000转，20min，离心收集上清，－70度冻存。
  裂解液有多种配方，这里有些资料可供参考
  western blot 标准操作流程
  http://www.*****.com/tuijian/ziliao/%BC%F8%B6%A8%BF%B9%CC%E5%C1%F7%B3%CC.pdf
  碧云天Western实验步骤
  http://www.beyotime.com/western.htm
  生物秀
  http://www.ebioe.com/bio101/Sear ... bmit=+%CB%D1%CB%F7+

• duoduo (2015-12-12 22:15:50)

  
  我想请问一下大家，从不会做WB到会做，到做好大概需要多长时间呢？最快学会的方法是什么呢？我明年毕业，但是实验还在设计阶段，十分苦恼。

• daod (2015-12-12 22:16:15)

  1） 单层贴壁细胞总蛋白的提取：
  1、 倒掉培养液，并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液（或将瓶直立放置一会儿使残余培养液流到瓶底然后再用移液器将其吸走）。
  2、 每瓶细胞加3ml 4℃预冷的PBS（0.01M pH7.2～7.3）。平放轻轻摇动1min洗涤细胞，然后弃去洗液。重复以上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。将PBS弃净后把培养瓶置于冰上。
  3、 按1ml裂解液加10 μ PMSF（100mM），摇匀置于冰上。（PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合。）
  4、 每瓶细胞加400 μ含PMSF的裂解液，于冰上裂解30min，为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动。
  5、 裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快），然后用枪将细胞碎片和裂解液移至1.5ml离心管中。（整个操作尽量在冰上进行。）
  6、 于4℃下12000rpm离心5min。（提前开离心机预冷）
  7、 将离心后的上清分装转移倒0.5min的离心管中放于-20℃保存。
  （个人感觉上述方法可操作性有待加强，细胞中蛋白本来就很少，一瓶50ml的细胞有时按照实验要求只能加100-200μ的裂解液，按照上述操作，直接用200μ裂解液进行裂解，根本就不够瓶壁上沾的。本人是先用预冷的PBS（一般数毫升）加入后，用细胞刮刮下细胞，转移至试管中，如果数瓶细胞是收集同一蛋白的，可以放在同一试管，离心后再将蛋白转移到EP管中，这样可操作性就比较强）