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酶联免疫吸附法测定促甲状腺激素
关键词：标准微粒 食品安全检测标准物质 农药多残留分析 环境监测标准物质酶联免疫吸附法测定促甲状腺激素
【实验原理】
先将抗促甲状腺激素(thyroid stimulating hormone，TSH)单抗包被于微孔板，再将标准品、标本血清、羊抗TSH抗体-HRP结合物加入微孔中，孵育，TSH与包被抗体和酶标抗体形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，洗板，以除去未结合的成分。然后加入TMB液并孵育20分钟产生蓝色，加入2mol／L HCl终止反应，用405nm波长测定吸光度，颜色深浅与TSH的量成正比。
【试剂与器材】
1．96孔微孔板已包被抗体。
2．抗体酶结合物抗TSH-HRP结合物。
3．参考标准品含量分别为OMIU／L、0．5MIU／L、2．0MIU／L、5．0MIU／L、10MIU／L、25MIU／L(冻干品)。临用前每瓶加蒸馏水lml复原，用后保存在2~8℃。
4．TMB显色剂在使用前15分钟将显色剂A和B按1：1比例混合。制各好的TMB试剂在室温避光条件下3小时内保持稳定。
5．终止液2mol／L HCl。
6．仪器酶标仪。
【操作步骤】
1．将所需微孔条在微孔架上放稳，加l00μl标准品、样品到相应的微孔中，最好做复孔。
2．每孔加100μ1抗体酶结合物，充分混合30秒，室温孵育60分钟。用前15分钟准备TMB液。
3．倒弃孔内液体，用蒸馏水洗板5次，每次将板在吸水纸上用力拍干以除去残留水滴。每孔加20μl TMB液，轻轻混合5秒，室温暗处孵育20分钟。
4．加2mol／L HCl 50μl终止酶反应。轻轻混匀30秒，保证蓝色完全变为黄色。在30分钟内于波长405nm处读取吸光度。
【结果计算】
1．计算标准品、样品的平均吸光度。
2．以标准品的平均吸光度作y轴，以标准品浓度MIU／L为x轴做校正曲线。
3．用样品的平均吸光度值，通过校正曲线求得相应的TSH浓度。
【参考区间】
0．4～7．0mlU／L(平均1．6mIU／L)
【临床意义】
血清TSH升高常见于原发性甲状腺功能减退、分泌TSH的垂体肿瘤、垂体性甲亢、缺碘性地方性甲状腺肿及异源性TSH综合征等。原发性甲状腺功能减退患者TSH的测定是最灵敏的指标，因甲状腺激素分泌减少，对垂体的反馈抑制减弱，TSH分泌增多；轻度慢性淋巴细胞性甲状腺炎、甲状腺功能亢进接131I治疗后和某些严重缺碘或地方性甲状腺肿流行地区的居民中，亦可伴有TSH的升高。异位或异源促甲状腺激素综合征，以及个别垂体肿瘤患者也会分泌TSH过多，引起甲亢。
血清TSH降低常见于各种原因所致的甲状腺性甲亢、继发性甲状腺功能低下和临床应用大剂量糖皮质激素。继发性甲状腺功能减退患者、甲状腺功能亢进患者TSH值正常或减低。在原发性甲状腺功能减退患者用甲状腺制剂替代治疗期间，可测定TSH作为调节药量的参考。
【注意事项】
1．TMB显色剂不稳定，故临用时现配。
2．每次弃孔内液体时务必拍干，不能残留，否则影响结果。
【评价与思考】
本法灵敏度比RIA法稍高，是替代RIA法较常用的方法，但本法手工操作较多，故精密度一般。现在出现的LIA、ECLIA和TRFIA具有更高灵敏度、精密度和特异性。
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