求助：我的PCR出问题了？有谁能帮帮忙吗？

最新回复

• 椰子叶子 (2011-10-04 16:32:56)

  我们反应条件一般都是这样：预变性：94 3分 循环：94 30秒 55 1分 72 1分 最后延伸：72 10分，这些可能对我们适应，或许你们有一些特殊的做法，我们可以交流一下

• 喵咪 (2011-10-04 16:33:21)

  这样的问题难答啊，我只能反提问了。
  
  1。PCR片段有多长。
  2。为什么EXTENSION TIME 需5分钟。
  3。 为什么ANNELLING TIME需2分钟。
  4。你能确定DNA提取方法完全可靠吗。为知道BIO 101 KIT 是碘化钠方法，你的 碘化钠是自治的吗。

• 莓菓333 (2011-10-04 16:33:52)

  你用一种方法检测的结果确实很难判断，如果阳性对照可以出来说明反应应该没问题。还有其他的检测手段来判断吗？

• 莓菓333 (2011-10-04 16:33:52)

  你用一种方法检测的结果确实很难判断，如果阳性对照可以出来说明反应应该没问题。还有其他的检测手段来判断吗？

• 土豆potato (2011-10-04 16:34:36)

  先谢谢各位的关注！
  我扩增的片断长度是 776 bp，之所以复性用2min，延伸用5min，这是我在参考别人的引物是别人用的是这个循环条件，我没有做改变而已，而且我还发现国内研究的人在用这对引物时用的也是这个循环参数，他们可以扩增出来。另外，碘化钠我用的是上海生工的进口分装试剂，试剂似乎没有问题，但是现在考虑的是可能碘化钠提取这种方法的可靠性了。 ：（

• 冰激凌小姐 (2011-10-04 16:34:57)

  我虽不知道你的问题出在那里了 ，但我可以肯定的认为 NaI提取DNA没问题的，我的NaI是国产的分析纯试剂 ，每次也能抽提出来 ，而且PCR扩增结果也还行啊，这点你不用怀疑啊，还是想想别的吧！

• 绿茶公子 (2011-10-04 16:35:16)

  1.根据你所说的情况最有可能的是taq酶，因为你延伸时间是5分钟，一般的taq酶扩增2～3Kb没有什么问题（换句话说就是延伸时间不超过三分钟），再长恐怕酶本身就要失活了。
  2.阳性对照没出，可能你的那个程序不适用于作阳性对照的DNA。再改改条件试一下。死抱着别人的条件不变不好，因为具体的试验条件都不一样。即便是同一种试剂不同公司出品的效果都不同。

• 韩梅梅 (2011-10-04 16:35:41)

  1.根据你所说的情况最有可能的是taq酶，因为你延伸时间是5分钟，一般的taq酶扩增2～3Kb没有什么问题（换句话说就是延伸时间不超过三分钟），再长恐怕酶本身就要失活了。
  2.阳性对照没出，可能你的那个程序不适用于作阳性对照的DNA。再改改条件试一下。死抱着别人的条件不变不好，因为具体的试验条件都不一样。即便是同一种试剂不同公司出品的效果都不同。
  
  =======================
  
  延伸5分钟，不会影响taq酶的。
  他的阳性对照已经出来了。

• 阿福 (2011-10-04 16:36:03)

  一：90度、1分钟, 62度、2分钟, 72度、5分钟
  这时间太长了吧！
  推荐94度45，55-60度60，72度90。我PCR的长度就跟你差不多。
  二：可以换一种样品处理方法试一下，处理病毒的方法多呢，随便在找一种。
  三：还有就是你在处理标本时手法有没问题阿，是不是把DNA or RNA 给丢了。
  四：根据你所说的“阳性对照可以扩增出来“，推测，你的样本里是不是加入了些抗凝剂比如肝素之类的东西，如够有的话估计你一辈子也做不出来的。
  五：找找原因，Good Luck!!!!

• 阿拉蕾 (2011-10-04 16:36:24)

  谈谈我的看法：
  1。我觉得该反应体系有问题。一般extension time为500bp 30‘，因此1000 bp 1分，楼上的确90也可以，但5分太长了。该反应denature T为90，是否妥当
  (sorry I can't input Chinese now). If you have a real time pcr machine, you can assay your pcr product with melt curve. but usually the denature T should be 94-96.
  Indeed the positive control came up, but that means nothing. Where did the positive control come from? was it a pcr product or something others? It is totally different from the sample made from blood or tissue. Will the postive control come up when the postive control is added to the sample made from blood?
  
  2.How many cycle number is in this pcr reaction? If the Taq enzyme is good, the cycle number can be up to 60 (Qiangen HotStar). Usaually the cycle number I use is 25-35, othetherwise there might appear false positive. Why didn't you increase the cycle number especially when your pcr came up nothing at the first beginning?
  
  3.I used NaI sometimes ago, It's Bio 101 kit. I think it is a very good one. The kit has beads in it. these beads used for absorption of DNA. Is there any bead in your NaI kit? I have no idea wherther there is a difference in this method or not, but I doubt there is a difference, at least the quality of the beads.

• 微笑的海豚 (2011-10-04 16:36:48)

  我觉得PCR条件肯定是不需要那么长的，才706bp啊，还有就是你的病毒，可能是由于保密的原因，你没有提到是哪一种病毒。是感染血细胞的病毒还是主要在血清中的病毒？如果是前者，提取是可以的；如果是后者，把血清从处理一下就可以做PCR了，没有必要去提取DNA。

• 土豆potato (2011-10-04 16:37:31)

  谢谢各位的关注！我做的是疱疹病毒，外周血中主要感染PBMC。真的是不好意思，到现在我还没做出来。退火温度降到60度（想提高扩增效率），酶量也已经增至2.0U；可是标本就是出不来。不知下一步应该怎么样改进？ 想请教各位一下PCR优化具体应怎样做？急盼回复！谢谢！

• 不懂 (2011-10-04 16:37:55)

  不知道你用的是什么阳性对照？
  如果是疱疹病毒阳性的外周血作对照，和标本同样抽提DNA，那很简单－－ 你的标本都是阴性的。
  
  如果你是用其它的阳性对照（同样的疱疹病毒模板），那问题应该是在DNA抽提了（因为你的反应体系可以扩增出对照，说明体系应该问题不大）
  
  如果是内参等作用对照，则可能的环节很多
  
  good luck  

• 不懂 (2011-10-04 16:38:12)

  预变性：94度、10分钟，当温度降到4度时加入1.5 U Taq酶，进入扩增循环；
  扩增循环：90度、1分钟, 62度、2分钟, 72度、5分钟
  
  =======================
  
  你的变性温度为什么是90℃？