大家见过目的基因出的来且很好,但actin不好的情况吗?

最新回复

• 大猫 (2011-10-05 15:49:50)

  我用的ß-actin是如下2条：（久经考验），供参考,可以委托引物合成相关公司合成，（PCR使用时的引物终浓度是100-400PMOL，）
  A：ß-actin
  F 5′-tct aca atg agc tgc gtg tgg-3′
  R 5′-gga acc gct cat tgc caa tg -3′(496bp, 58-60℃)
  B： ß-actin
  F 5′CGAGAAGATGACCCAGATCA-3
  R5′-GATCTTCATGAGGTAGTCAG-3 (234bp 55℃)

• 阿福 (2011-10-05 15:51:00)

  我的猜测是您的β-actin引物扩增片段是跨内含子的，您提的RNA中有DNA污染，这样，实际上扩增出来比预计带大的带的是以基因组DNA为模板的扩增产物。
  
  作内参的β-actin引物其实在很多杂志上可以找到的，也不是什么都可以拿来用啊，还得看是什么物种的吧，比如您是作老鼠的，拿鸡的β-actin引物来用，效果一定不会好吧？
  
  我最近遇到的问题是，我用的Invitrogen 的TRIzol提的RNA，按protocol, 提过RNA后，剩下的东西可以拿来提DNA，于是我按Invitrogen方法提了DNA，我所用的β-actin引物是跨内含子的，用cDNA扩增后得到了预期大小的带，我想，如果用DNA为模板来扩增的话应该得到更大的带才对，可是我用DNA为模板所得到的扩增带与用cDNA为模板得到的扩增带同样大小，这就让我费解了，难道我提的DNA有RNA污染？可是，既使污染了，没有转录，没有cDNA，又如何扩增得出来呢？
  
  还请有经验得兄弟指点一下咯。

• one (2011-10-05 15:52:08)

  font=宋体]非常感谢提供的引物.还有一个问题,(不好意思,上面我忽略了)你的β-actin是什么物种的?我做的是大鼠.

• one (2011-10-05 15:52:52)

  真佩服你的见的,分析的非常有道理.我的β-actin引物扩增片段确实是跨内含子的.且我也查过若模板为DNA,预计产物应在1200-1300之间,因为这对引物的下游引物中包含了一段内含子.
  还有两个问题请教?
  如何避免RNA中污染DNA,有人说可以用无RNAse的DNAse消化,但他同时又说这类产品经常不合格.有没有其他办法?
  我们在设计RT-PCR的引物时,是应该尽量避免扩增片段跨内含子以减少非特异呢?还是应该必须包含内含子以确定扩出来的是cDNA?

• 大猫 (2011-10-05 15:53:22)

  看到你的帖子后，想把我的β-actin的引物序列在进行blast后，再给你回复。由于现在网站上一直显示ERROR: Nucleotide FASTA provided for protein sequence：所以一时无法blast后给你结果，但我们平时大部分情况下，是进行人的基因组，但是有四位研究生是做大鼠的肝脏和心脏，是采用我给你两对引物，结果也非常理想，由于大鼠和人的基因同源性很大，所以你应该可以用。

• 大猫 (2011-10-05 15:53:46)

  刚进行完提供的β-actin 的blast比对，结果人、褐家鼠，小鼠都有匹配序列，OK
  你自己在看看吧。

• tears (2011-10-05 15:55:00)

  楼上分析得很有道理，我也是这样认为的。我认为解决问题的最好方法是重新设计引物！理论上讲，设计引物时要跨越一个内含子，但要注意：让其中一条引物要跨越一个内含子（就是一条引物的部分碱基在前一个外显子，部分在相邻的下一个外显子），不要让内含子在两条引物之间！！你永远都不要指望百分百质量的试剂，因为现在的试剂你不能完全保证能够除去DNA，所以我认为最好的方法就是设计引物！

• tears (2011-10-05 15:55:00)

  楼上分析得很有道理，我也是这样认为的。我认为解决问题的最好方法是重新设计引物！理论上讲，设计引物时要跨越一个内含子，但要注意：让其中一条引物要跨越一个内含子（就是一条引物的部分碱基在前一个外显子，部分在相邻的下一个外显子），不要让内含子在两条引物之间！！你永远都不要指望百分百质量的试剂，因为现在的试剂你不能完全保证能够除去DNA，所以我认为最好的方法就是设计引物！

• one (2011-10-05 15:55:53)

  非常感谢大家的帮助,我已经成功的P出了γ-actin.
  但大家用这个做内参的好象不多.
  不会我辛辛苦苦做出来国际上不承认吧?

• 喵咪 (2011-10-05 15:56:33)

  一般是表达保守的，但实际中也会有特别情况的，我们实验组就出现过28S的表达在处理组和正常组很不一样，最后选用GAPDH来做。我们是用TotalRNA来做RT，然后用cDNA来做模板PCR，很容易就扩增了几种actin，在用mRNA设计PCR的引物的时候，尽量使扩增片段靠近poly-a ,因为RT是从这端开始的。用SYBR荧光燃料做验证，先进可靠便宜！