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[求助]这样的PCR能做出来吗？

字体: 小 中 大 | 打印 发表于: 2011-10-05 16:30    作者: 云端ing    来源: 分析测试百科网

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[求助]这样的PCR能做出来吗？


BOSS最近让我试着做一个扩增只有24bpDNA的PCR，primer只有6bp长，计算Tm大概只有十几度。做了两次（一次退火中心温度为40度，一次为25度），PAGE胶上什么东西都没有，除了溴酚蓝真是光板一个。我怀疑是公司合成的单链模板和引物因为太短有质量问题，测OD值说明溶液中DNA量偏差不大。在跑其他的非变性PAGE时试着把模板（单链）点在加样孔里跑，结果是出现一个很模糊的拖得比较长的影子。
各位说这样短的模板和引物能做出PCR出来吗？为什么跑胶会一点鬼影都没有呢？我跑过引物12bp长，模板59bp长的PCR，优化条件后跑出来的很漂亮。
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最新回复

  • caihong (2011-10-05 16:32:27)

    你还不如直接合成正、反义链，再直接退火得到24bp的产物！

  • caihong (2011-10-05 16:32:27)

    你还不如直接合成正、反义链，再直接退火得到24bp的产物！

  • 二丫头466 (2011-10-05 16:41:39)

    后续实验也需要在一定时候对这样24bp的链做PCR扩增，不然我们也不会自找麻烦象这样挑战PCR极限啊。

  • 绵绵 (2011-10-05 16:42:35)

    直接合成两条链吧。为什么不把摸板搞长点？

  • 绵绵 (2011-10-05 16:42:35)

    直接合成两条链吧。为什么不把摸板搞长点？

  • 阿拉蕾 (2011-10-05 16:43:12)

    assemlby pcr。
    flash（版权所有）


    39219787.gif

  • 98776langtao (2011-10-05 16:52:21)

    退火到4度。
    不知道什么时候需要做这样的PCR，肯定有其他方案可以替代。
    我就合成过30bp的两条互补的引物，预留酶切位点，退火之后直接连接载体就行了。  

  • 98776langtao (2011-10-05 16:52:21)

    退火到4度。
    不知道什么时候需要做这样的PCR，肯定有其他方案可以替代。
    我就合成过30bp的两条互补的引物，预留酶切位点，退火之后直接连接载体就行了。  

  • 花裙子 (2011-10-05 16:53:01)

    这么短的基因不如直接合成吧，没多少钱的
    还有人直接合成500多bp的基因呢！（当然他是有钱人）

  • 8黑眼圈8 (2011-10-05 16:53:21)

    为什么不直接分别合成正义和反义的DNA，
    使其末端互补，然后用klenow进行延伸呢

  • 莓菓333 (2011-10-05 16:53:53)

    楼上师兄，能解释一下具体操作步骤吗，初来乍道，希多多指点

  • 白白的 (2011-10-05 16:55:07)

    楼上办法好，恐怕很多Primer dimer就是这么形成的。有protocol吗？好像也没有做这么短的吧？

  • 嘉年华 (2011-10-05 16:55:48)

    谢谢主任！
    独家秘方！
    我把这个方法用于合成较短的DNA片断，PCR的protocol和普通的一样。
    你说的短是不是指中间互补的地方？一般要求8bp以上，我自己应用时要长一些，省得给自己找麻烦。

  • 花裙子 (2011-10-05 16:56:18)

    恩， 很有意思，有机会我也试试。你试过总长度最小可以多少bp?

  • 鸽子不哭 (2011-10-05 16:56:43)

    你合成短DNA 也用的是标准PCR的时间，温度控制吗，有什么别的要求，如酶啊等等，向你求教了。
    谢谢！

  • 晶晶亮 (2011-10-05 16:57:53)

    我长的试过80bp和100bp的2段引物，中间20bp互补，合成的片断160bp。
    短的约60bp，没有再试过短的。
    PCR的每步的时间你可以自己决定，比如一般情况解链30“，退火30秒，对于这么短的PCR产物，30”足以（DNA聚合酶每分钟合成1000bp），温度只有退后温度需要根据你的引物决定，其它的都一样。
    对于酶没有什么特殊的要求，PCR引物需要纯化。

  • 晶晶亮 (2011-10-05 16:57:53)

    我长的试过80bp和100bp的2段引物，中间20bp互补，合成的片断160bp。
    短的约60bp，没有再试过短的。
    PCR的每步的时间你可以自己决定，比如一般情况解链30“，退火30秒，对于这么短的PCR产物，30”足以（DNA聚合酶每分钟合成1000bp），温度只有退后温度需要根据你的引物决定，其它的都一样。
    对于酶没有什么特殊的要求，PCR引物需要纯化。

  • mooon (2011-10-05 16:58:32)

    有LCR（ligase chain reaction）方法用于检测突变，两条引物完全覆盖扩增片段；可不可以认为这是极限呢？

  • 还是孩子 (2011-10-05 16:59:23)

    我长的试过80bp和100bp的2段引物，中间20bp互补，合成的片断160bp。
    短的约60bp，没有再试过短的。
    PCR的每步的时间你可以自己决定，比如一般情况解链30“，退火30秒，对于这么短的PCR产物，30”足以（DNA聚合酶每分钟合成1000bp），温度只有退后温度需要根据你的引物决定，其它的都一样。
    对于酶没有什么特殊的要求，PCR引物需要纯化。

    ===============================================================================================================

    PCR引物纯化是什么概念，我是刚合成的引物用水稀释的，可不可以直接用呢，还有1OD干粉没有稀释，如果想要用你的方法合成目的链该如何做？
    我的合成序列有27bp 用94度，30'' 54度30'' 72 度20''可以吗，需要多少个循环呢，这个设计行不行，谢谢指点。

  • 还是孩子 (2011-10-05 16:59:23)

    我长的试过80bp和100bp的2段引物，中间20bp互补，合成的片断160bp。
    短的约60bp，没有再试过短的。
    PCR的每步的时间你可以自己决定，比如一般情况解链30“，退火30秒，对于这么短的PCR产物，30”足以（DNA聚合酶每分钟合成1000bp），温度只有退后温度需要根据你的引物决定，其它的都一样。
    对于酶没有什么特殊的要求，PCR引物需要纯化。

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    PCR引物纯化是什么概念，我是刚合成的引物用水稀释的，可不可以直接用呢，还有1OD干粉没有稀释，如果想要用你的方法合成目的链该如何做？
    我的合成序列有27bp 用94度，30'' 54度30'' 72 度20''可以吗，需要多少个循环呢，这个设计行不行，谢谢指点。
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