[求助]PCR 紧急求救！

最新回复

• 冰激凌小姐 (2011-10-06 11:19:39)

  你用的什么电泳液啊  

• 131415 (2011-10-06 11:21:08)

  TBE

• 131415 (2011-10-06 11:21:08)

  TBE

• @花开花落@ (2011-10-06 11:21:37)

  我也出现过类似情况,考虑主要有一下原因
  1 除模版外体系有污染,解决方法作个阴性对照看看,不加模板,加水.还有带则说明有污 染外源DNA.
  2 你朋友的酶质量下降了,或者有污染.再换别人的酶看看.吹打有没有混匀?
  3 作个阳性对照,看看你的电泳有没有问题
  另外,二次PCR我仅作过一次,也是在条件不好时作的,当时没稀释,结果杂带很多,主带不清楚.感觉不是很好作.尤其是体系不很干净的时候.
  不要灰心,PCR还是PCR,虽然有时不稳定.这很可能还是操作和试剂还有条件的问题.

• =菓子= (2011-10-06 11:22:17)

  1.引物出问题，可能是降解了，解决方法：重新配引物或者加大引物量，
  2.酶出问题，可能性不大，因为实验中还有非特异带嘛。
  3.NEST-PCR时，将第一次PCR产物做10-20倍稀释。

• 韩梅梅 (2011-10-06 11:22:45)

  （酶出问题，可能性不大，因为实验中还有非特异带嘛），表达不准确，主要是指：酶没有降解意思。现在实验结果出现非特异带和每次PCR结果条带大小不同，很有可能是酶的质量出问题，这种酶质量出问题的表现是：在PCR结果中，不是没有条带，而是非特异带，（所以不容易想到是酶出问题了！）特别是国产的酶，记得过去有些生产TAQ酶的单位，经常免费送给我们试用，结果就是出现非特异带多的现象，开始还认为是酶活力太高，其实就是酶的质量有问题，这种酶是不能使用的！浪费人力，物力。至于是什么原因造成这些质量有问题的酶的PCR结果中，出现非特异带多的现象至今还不清楚，不知有那位高手能够赐教！谢谢！
  NEST-PCR时，由于是将第一次PCR产物做为模板,所以NEST-PCR的结果,一般特异性较高,非特异带现象较少出现，NEST-PCR结果出现杂带较多现象与第一次PCR产物是否有适当稀释关系不大，可以将第一次PCR产物适当稀释后,或者干脆不稀释,因为有人在同一反应管中,同时加入内,外引物,先在较高温度扩增外引物,再在较低温点进行内引物扩增;如果NEST-PCR结果出现杂带较多，应该考虑酶的质量和反应的温点。

• 131415 (2011-10-06 11:24:48)

  那二次PCR的退火温度应该降低吗，我觉得应该提高才对啊，文献上也是在二次PCR时提高了退火温度，你说的降温有没有什么依据啊。
  谢谢回复

• 韩梅梅 (2011-10-06 11:25:18)

  在同一反应管中,同时加入内,外引物,先在较高温度扩增外引物,再在较低温点进行内引物扩增。这样做是保证内引物在较高退火温度时，不会参加PCR反应，待外引物反应后，达到平台期后，通过降低退火温度，使内引物参与PCR反应。至于文献上也是在二次PCR时提高了退火温度，道理也一样，就是通过不同的温点使内,外引物分开参加PCR反应，外引物优先反应；但PCR采用先高温，后低温方式更常见。如果内,外引物同一温点都能反应，就不能在同一反应管中，进行NEST-PCR了。