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[求助]PCR没有结果，呜呜！

字体: 小 中 大 | 打印 发表于: 2011-10-07 11:39    作者: HP007    来源: 分析测试百科网

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[求助]PCR没有结果，呜呜！


新手做PCR总是没有条带，请各位大虾指点：
引物 P1 gt GTCGACTCATGACGGAAAGACTCGTTTG Tm 54.3
P2 gc CTCGAG TTACCTTCTTCGCTGACCATTTAG Tm 53.8
目的序列 2.5kb
50微升体系：dNTP 4微升
P1 1微升
P2 1微升
10*buffer 5微升
Mg离子 3微升
模板 1微升（细菌基因组DNA，浓度不太清楚，电泳看无明显降解）
Taq 1微升
dd水 34微升
冰上配好后分装5管，反应条件：
94度，3min; 94度，1min; 49度-51度，1min30sec; 72度，1min ;30循环，72度延伸7min。
p了几次除隐约可见二聚体外都没有任何条带。可能是什么问题？请高手指教。
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最新回复

  • =菓子= (2011-10-07 11:40:24)

    1）模板保证没有问题。
    2）增加Mg离子量，可以加到4微升。
    3）你的片段太长，可以换Taq EX试一试。
    4）把反应条件再优化一下，退火温度可以再降低点。
    5）如果还不行，dNTP和引物可能有问题。

  • HP007 (2011-10-07 11:43:20)

    刚才又P了一次。
    Mg离子提高到 3.5微升；
    反应条件改为：94度，3min; 94度，1min; 46.6度-53.8度，1min; 72度，1min30sec ;35循环，72度延伸10min; 换了模板（别人用此模板可以p出700bp片段）。
    结果：
    用 EX Taq buffer加普通taq酶，每组都有二聚体，温度升高二聚体带增强。
    用普通taq酶加普通buffer,同样条件下什么带都没有，连二聚体带也没有。

    该怎么调整呢？是不是该换酶？（boss 口袋里的金子有限）另外，是该用EXTaq 还是LA Taq? 哪个公司的性价比最好？

  • 金手指 (2011-10-07 11:44:20)

    PCR不出结果有几种情况：
    1。温度问题，看样子你的温度应该是没有什么问题。
    2。mg的问题，但3微升已经够了
    3。taq的问题，我想试剂的问题先不要考虑，排除别的问题在说这个。
    4。我个人认为有没有可能是pcr反应液浓度太高。里面浓度如果过高，会没有空间进行复性。这样扩增的量就很有限了。
    个人意见，仅供参考。
    对于性价比高的试剂，我还是觉得晶美的好，虽然有点贵，但出结果才是想看到的，不是么？

  • 胖小妮子 (2011-10-07 11:44:48)

    "我个人认为有没有可能是pcr反应液浓度太高。"

    能说详细一点吗？就我的体系而言，应该怎么调整呢？  

  • 春雨 (2011-10-07 11:45:15)

    基因组模板和引物反复冻融就不好了，换新的试一下，另外可以增加1-2min的预变性时间

  • @木木@ (2011-10-07 11:45:39)

    我也认为因为你的目的片段比较大，所以你要保证你的模板充分变性，至少5min，有必要的话也可以增至10min预变性后加酶，还又就是增加你延伸的时间

  • 韩梅梅 (2011-10-07 11:46:02)

    除了以上说的，我认为最可能出问题的地方就是你的引物了，你可以再设计设计，引物的设计在园子里很容易找到。另外，你的模扳量太少，我做的时候一般都是递增的加，1ul不出就2，5，10，20ul都试试，我前两天pcr加到10ul都没处，结果20就出了，推荐采纳  

  • 大猫 (2011-10-07 11:46:26)

    我建议你可以换小体系做一下,或者是每步的时间都延长.因为你合成的目标太大.可以把退火时间再降低一点试试,出了目标带好再根据结果进行调整,现在主要任务是要有目标带出现,无论产物质量如何.,

  • 快乐的大脚 (2011-10-07 11:46:44)

    把你的目的序列的Genebank ID号告诉我一下，然后再PM我提醒一下，我帮你看看。

    你的PCR时间肯定有问题，如果你的PCR仪不是太古董的话，那你的退火和延伸时间就太离谱了。

  • HP007 (2011-10-07 11:47:13)

    回来看到这么多热心人，好感动。
    弱弱地问eeflying，我的退火和延伸时间该怎么设？

  • HP007 (2011-10-07 11:47:13)

    回来看到这么多热心人，好感动。
    弱弱地问eeflying，我的退火和延伸时间该怎么设？

  • HP007 (2011-10-07 11:47:58)

    又P了一次，
    25微升体系：
    dNTP 2微升
    P1 0.5微升
    P2 0.5微升
    Ex buffer 2.5微升
    Mg离子 1.5微升
    模板 4微升（对数生长期细菌，用裂解液煮沸后的上清）
    Taq 0.5微升
    dd水13.5微升
    反应条件：
    94度，5min; 94度，1min; 45度，1min30sec; 72度，1min ;35循环，72度延伸10min。

    只有二聚体。急疯了。

  • 98776langtao (2011-10-07 11:48:31)

    先排除模板的问题,建议先用你的DNA模板,用别人成功的PCR反应体系,包括人家的引物做PCR,并建立对照.

  • @花开花落@ (2011-10-07 11:48:54)

    你应将延伸时间变为3分钟，再试试，预变性改为96度5---10分钟，再加酶。

  • HP007 (2011-10-07 11:49:31)

    结果好奇怪。本来想做一个阳性对照。我用别人的引物和模板，完全按照别人成功的体系和条件，只是用我的酶、dNTP和MgCl2,buffer和水等等，只能隐隐约约看到在目的片段的位置似有似无的条带（加了10微升样）。同时用我的模板加别人的引物，扩出来的情况也是这样。狂郁闷。

  • she (2011-10-07 11:50:09)

    个人意见：
    将预变性时间延长为4－5min，循环延伸时间延长为2.5min，总延伸时间延长为15－20min试试！另外，模板没问题的话，再不行换换引物！
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