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[求助]MSP技术求救

字体: 小 中 大 | 打印 发表于: 2011-10-07 14:33    作者: yonger    来源: 分析测试百科网

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我在做甲基化特异pcr,我有几个问题想请教.第一,我用promega的wizard DNA clean up system纯化未经亚硫酸氢钠等处理的基因组DNA后(这样做主要是为了验证是否纯化步骤丢失DNA),电泳就找不到基因组DNA了.请问你们在做时有没有类似情况?我应该怎么办?第二,亚硫酸氢钠和氢醌是不是必须买国外的产品,可不可以用国产试剂代替?第三,pcr循环是不是必须用hot start pcr?

最后,我实验方面没有经验,在DNA处理新方法一文中提到的第二天的纯化方法,就是以下步骤:请各位高人指点
第二天

8   1%琼脂糖，每管加1ml，样品数*2，放200ulTip头，凝固。
9  把样品吸出，至孔中，1小时后转移至另一空，再放置1小时。

"每管加1ml"是指什么管?"样品数*2，放200ulTip头，凝固",这不我不理解是怎么做的,不好意思,能不能解释一下.
"把样品吸出，至孔中，1小时后转移至另一空，再放置1小时"哪里有孔?对不起请指点一下.
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最新回复

  • 生物迷 (2011-10-07 14:36:00)

    很高兴能看见一个做MSP的同道。
    我用的是QIAGEN的纯化柱，没有跑过胶，不过用紫外比色发现回收可以达到70-80%，具体protocol和效率我仍在摸索中，希望互相探讨。

  • 生物迷 (2011-10-07 14:36:38)

    我用亚硫酸氢钠处理DNA后，过柱后紫外分光可以有50%的回收，再经乙醇沉淀回收又是50%，总共计算，回收只有25%，请问大家，回收是否的确这样少？更糟的是，我把最后的回收产物去跑胶，根本没有条带，我应该相信哪个呢？按说EB的灵敏度是很高的啊，紫外都看得到了，它就应该有东西表现。  

  • mooon (2011-10-07 14:37:07)

    EB只与双链DNA结合，单链DNA跑胶当然看不见

  • 生物迷 (2011-10-07 14:37:49)

    是这样吗？那RNA跑胶怎么解释呢？

  • 菠萝菠萝蜜 (2011-10-07 14:38:30)

    我在做甲基化特异pcr,我有几个问题想请教.第一,我用promega的wizard DNA clean up system纯化未经亚硫酸氢钠等处理的基因组DNA后(这样做主要是为了验证是否纯化步骤丢失DNA),电泳就找不到基因组DNA了.请问你们在做时有没有类似情况?我应该怎么办?第二,亚硫酸氢钠和氢醌是不是必须买国外的产品,可不可以用国产试剂代替?第三,pcr循环是不是必须用hot start pcr?

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    1. 我们用的也是promega的wizard DNA clean up system盒子，870元。纯化后，我们试了一次，确实没有显示出DNA，当时也觉得奇怪，原因至今不明。我个人认为，由于纯化时取的模板DNA量很少（我们取的是2ul），纯化后，是用50ul TE溶解的，故模板量很少，取如此稀释的10 ul DNA跑电泳，我个人认为可能是模板的量太少，无法显示出来。

    2.亚硫酸氢钠和氢醌，我们用的都是国产的，应该没有问题，这些不是生化试剂，分析纯就可以了。

    3.不明白你的“hot start pcr”指什么，一般PCR就可以了，但由于MSP的引物的退火温度一般都比较高，摸索PCR循环条件还是需要一些时间的，建议你购买华美公司的Taq酶，它的最适延伸温度是74℃，比大多数的高2℃，与退火温度拉的大一点。此外，有些引物的PCR还需要做一些优化，如加入DMSO等。

  • qqq111 (2011-10-07 14:39:05)

    只有大量的单链才看得见

  • 二丫头466 (2011-10-07 14:39:41)

    非常感谢各位的宝贵意见。后来我对纯化后的DNA进行了扩增，发现纯化过程没有问题。现在我扩增出了非甲基化产物，但是没有甲基化产物。我想用Sss－1甲基化酶处理DNA做阳性对照（在37度下1小时），但没有成功。请问有没有哪位用过这个酶，具体的反应体系你们是怎么配制的？延长37度下的时间有没有用？  

  • yonger (2011-10-07 14:40:14)

    我想用Sss－1甲基化酶处理DNA做阳性对照（在37度下1小时），但没有成功（非甲基化产物出现，而没有甲基化产物）。请问有没有哪位用过这个酶，具体的反应体系你们是怎么配制的？延长37度下的时间有没有用？

  • 生物迷 (2011-10-07 14:41:11)

    是Mss-I吧？有专家推荐过，不过我还没有着手去查，不知楼上的做了没有，感觉如何？  

  • mamamiya (2011-10-07 14:41:52)

    我也要做msp,不知有没有做MLH1,MSH2的同道，交流一下吧，YOER能否将亚硫酸氢钠处理DNA的步骤mail to me

  • 生物迷 (2011-10-07 14:44:10)

    非常感谢各位的宝贵意见。后来我对纯化后的DNA进行了扩增，发现纯化过程没有问题。现在我扩增出了非甲基化产物，但是没有甲基化产物。我想用Sss－1甲基化酶处理DNA做阳性对照（在37度下1小时），但没有成功。请问有没有哪位用过这个酶，具体的反应体系你们是怎么配制的？延长37度下的时间有没有用？

    ===============================================================================================================

    我用过这个试剂盒，开始也失败了，后来仔细看了说明做出来了，可否把的做的步骤写出来，我们探讨一下。按说明书操作即可，我用的试剂盒步骤简略如下：
    dna 1ug
    SSSI 0.25ul（1个单位）
    SAM(200×) 1/200体积（可略多）
    10×buffer 1/10体积
    补水至所需体积
    混匀
    37度1小时
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