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[求助]P得不好，肿么办?
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在下最近正在跑pcr，以前用的引物是我找同学帮忙设计的，但是p得效果不是很好，摸了很多条件，包括调Mg离子的浓度、cDNA的浓度以及退火温度等，都p了一个多月了，结果还是一塌糊涂，偶尔能跑出一次目的条带，但一直很不稳定，而且目的条带很窄很淡，最经常发生的是一条很模糊的条带，或者一大堆杂带，内参照倒是跑的很好，不管多少温度退火，从51度倒62度都能跑出很亮的一个条带，正极度郁闷ing！
每一次的pcr我都充满希望与憧憬；每一次的电泳结果都让我吐血！一次次的希望破灭让我心身疲惫；一次次的不灭的希望让我又在PCRing！
如今在下不得已来求助各位高手，帮忙看一下在下得引物是否合适？如果不合适得话还请高手帮忙设计一个合适的，在下愿以积分10分相赠，了表寸心，如果p的效果非常好的话，在下所有的积分您都可以拿去，非常期待高手的帮忙，谢谢。
这是我用的引物： SENSE ::: CAGGACACAGAGTTGGAGCAGATTTAGTGC
ANTI-SENSE:::GGTTCAGGATCCCATCTTCCATTGATGCAG
这是我的目的基因全长：
> 1 ctgctcccag atagatccaa gacatgagac tgtcagcaag aattatttgg cttatattat
> 61 ggactgtttg tgtagcagaa gattgtaaag gtcctcctcc aagagaaaat tcagaaattc
> 121 tctcaggttc gtggtctgaa caactatatt cagaaggcac tcaggcaacc tacaaatgcc
> 181 gccctggata ccgaacactt ggtactattg taaaagtatg caagaatgga gaatgggtac
> 241 cttctaaccc atcaaggata tgtcggaaaa ggccatgtgg gcatcccgga gacacaccct
> 301 ttgggtcctt taggctggca gttggatctg aatttgaatt tggtgcaaag gttgtttata
> 361 catgtgatga agggtaccaa ctcttaggtg aaattgatta ccgtgaatgt gatgcagatg
> 421 ggtggaccaa tgatattcca atatgtgaag ttgtgaagtg cttgccagtg acagaactgg
> 481 agaatggaag aattgtgagt ggtgcagccg aaccagacca ggaatattat tttggacagg
> 541 tggtacgctt tgaatgcaac tccggcttca agattgaagg acagaaagaa atgcactgct
> 601 cagaaaatgg cctctggagc aatgaaaagc cacagtgtgt ggaaatttct tgcctgccac
> 661 cacgagttga aaatggagat ggtatatatc tgaaaccagt ttacaaggag aatgaaagat
> 721 tccaatataa atgtaagcaa ggttttgtgt acaaagaaag aggggatgct gtctgcacgg
> 781 gttctggatg gaatcctcag ccttcctgtg aagaaatgac atgtttgact ccatatattc
> 841 caaatggtat ctacacacct cacaggatta aacacagaat tgatgatgaa atcagatatg
> 901 aatgtaaaaa tggcttatat cctgcaaccc gatcacctgt ttcaaagtgt acaattactg
> 961 gctggatccc tgctccaaga tgtagcttga aaccttgtga ttttccacaa ttcaaacatg
> 1021 gacgtctgta ttatgaagaa agccggagac cctacttccc agtacctata ggaaaggagt
> 1081 acagctatta ctgtgacaac gggtttacaa cgccttcaca gtcatactgg gactaccttc
> 1141 gttgcacagt aaatgggtgg gagcctgaag ttccatgcct caggcaatgt attttccatt
> 1201 atgtggaata tggagaatct ttatactggc aaagaagata tatagagggt cagtctgcaa
> 1261 aagtccagtg tcacagtggc tatagtcttc caaatggtca agatacaata ttatgtacag
> 1321 aaaatggctg gtcccctcct cccaaatgcg tccgtatcaa gacttgttca gtatcagata
> 1381 tagaaattga aaatgggttt ttttctgaat ctgattatac atatgctcta aatagaaaaa
> 1441 cacggtatag atgtaaacag ggatatgtaa caaataccgg agaaatatca ggaataatta
> 1501 cttgtcttca agatggatgg tcacctcgac cctcatgcat taagtcttgt gatatgcctg
> 1561 tatttgagaa tgctatgact aagaataata acacatggtt taaactcaat gacaaattag
> 1621 actatgaatg tcacattgga tatgaaaatg aatataaaca taccaaaggc tctataacat
> 1681 gtacttatga tggatggtct agtacaccct cctgttatga aagagaatgc agcattcccc
> 1741 tgttacacca agacttagtt gtttttccca gagaagtaaa atacaaagtt ggagattcgt
> 1801 tgagtttctc ttgccgttca ggacacagag ttggagcaga tttagtgcaa tgctaccact
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最新回复
131415 (2011-10-08 09:38:16)
> 1921 ttgaaatccc gaatggggaa ataaagggaa caaaaaaagt tgaatacagc catggtgacg
> 1981 tggtggaata tgattgcaaa cctagatttc tactgaaggg acccaataaa atccagtgtg
> 2041 ttgacgggaa gtggacaacc ttgccgatat gcgttgagta tgagagaaca tgtggagacc
> 2101 ttcctgaact tgagcatggc tctgtcaagt tatctgtccc tccctaccat catggagatt
> 2161 cagtggagtt cacttgtaca gaaaccttca caatgattgg acatgcagta gttttctgca
> 2221 ttagtggaag gtggaccgag cttcctcaat gtgttgcaac agatcaactg gagaagtgta
> 2281 aagccccgaa gtcaactggc atagatgcaa ttcatccaaa taagaatgaa tttaatcata
> 2341 actttagtgt gagttacaga tgtagacaaa agcaggagta tgaacattca atctgcatca
> 2401 atggaagatg ggatcctgaa ccaaactgta caagaaatga gaaaagattc tgccctcctc
> 2461 ccccacagat tccaaatgcc caagtgattg aaaccacagt gaaatacttg gatggagaga
> 2521 aagtatctgt tctttgccaa gatggttacc taactcaggg cccagaagaa atggtgtgta
> 2581 aacatggaag gtggcagtcg ttaccacgct gcacggaaaa aattccatgt tcccagcccc
> 2641 ctaaaattga acatggatct attaagtcgc ccaggtcctc agaagagaga gatttaattg
> 2701 agtccagcag ttatgaacac ggaactacat tcagctatgt ctgtgatgat ggattcagga
> 2761 tatctgaaga aaatagggta acctgcaaca tgggaaaatg gagctctctg cctcgttgtg
> 2821 ttggaatacc ttgtggaccc ccaccttcaa ttcctcttgg tattgtttct catgaactag
> 2881 aaagttacca atatggagag gaggttacat acaattgttc tgaaggcttt ggaattgatg
> 2941 gaccagcatt tattaaatgt gtaggaggac agtggtctga acctcccaaa tgcataaaaa
> 3001 ctgattgtga caacttgccc acatttgaaa ttgccaaacc gacagaaaag aaaaaaaaat
> 3061 catacaggtc aggagaacaa gtgacattca gatgtccacc tccgtatcga atggatggct
> 3121 ctgacattgt cacatgtgtt aatacgaagt ggattggaca gccggtatgc aaagataatt
> 3181 cctgtgtgaa tccaccacat gtgccaaatg ctactatact aacaaggcac aagactaaat
> 3241 atccatctgg tgacaaagta cgttatgact gtaataaacc ttttgaatta ttttggggaa
> 3301 gtggaagtga tgtgcccaaa acgggatttt ggacagaacc accgaaatgc aaagattcaa
> 3361 cagggaaatg tgggcctcct ccacctattg acaatggaga catcacctcc ttgtcattac
> 3421 cagtatatgc accattatca tcagttgaat atcaatgcca gaactattat ctacttaagg
> 3481 gaaataagat agtaacatgt agaaatggaa agtggtctca gccaccaacc tgcttacatg
> 3541 catgtgtgat accagaagat attatggaaa aacataatat agttctcaga tggagggaaa
> 3601 atgcaaagat ttattcccaa tcaggggaga atattgaatt catgtgtaaa cctggatata
> 3661 gaaaattcag aggatcacct ccgtttcgta caaagtgcat tgagggtcac atcaattatc
> 3721 ccacttgtgt ataaaatcgc tatacaatta ttagtaaacc ttatggatga acctttgttt
> 3781 agaaatgcac atgtatatta ctaatacagt ttgaatttac atttgaaata ttgtttagct
> 3841 catttcttct aataagtata taaacttttt ttatatggtg gttaatcaag taactttaca
> 3901 gactgttgcc acaaagcaag aacattacat tcaaaactcc taatccaaaa tatgatatgt
> 3961 ccaaggacaa actatgtcta agcaagaaaa taaatgttag ttcttcaatg tctgttttta
> 4021 ttcaggactt ttcagatttt cttggatacc ttttgttgta ggttctgatt cacagtgagt
> 4081 ggaagacaca ctgactctga cttcaaatta gtattacttg ccaatacata acaaccaaac
> 4141 tatcataata tcacaaatgt atacagctaa ttactgtgtc ctacctttgt atcaataaag
> 4201 aaatctaaga aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaa
阿拉蕾 (2011-10-08 09:38:59)
如果我下星期能P的出来，我就给你推荐一对，不过30bp的引物确实很难设计。短些不行吗？
131415 (2011-10-08 09:39:31)
非常期待高手的指点
jude (2011-10-08 10:14:43)
jude (2011-10-08 10:14:43)
131415 (2011-10-08 10:16:48)
扑啦啦 (2011-10-08 10:17:28)
考虑一下：是不是内参竞争性抑制！
几率挺小。
可以试一试后加内参引物。
扑啦啦 (2011-10-08 10:17:28)
考虑一下：是不是内参竞争性抑制！
几率挺小。
可以试一试后加内参引物。
金手指 (2011-10-08 10:18:11)
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如果能排除引物的问题，那最坏的情况莫不是你的目的蛋白在该组织中的表达量极少或者根本就不表达，那么扩不出目的条带就是自然的现象了！
131415 (2011-10-08 10:19:12)
考虑一下：是不是内参竞争性抑制！
几率挺小。
可以试一试后加内参引物。
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我是分开跑的，不是一管
131415 (2011-10-08 10:20:44)
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我的目的蛋白的表达是百分之百确定的事，但具体表达的量的多少我就不清楚了，确定该蛋白表达的多少也是我实验的目的之一。
#甜# (2011-10-08 10:22:51)
sense:5>AAGTTATCTGTCCCTCCCTA<3 Tm=50.6 GC%=45 rating=100
anti-sense:5>TTCATACTCCTGCTTTTGTC<3 Tm=50.1 GC%=40 rating=84
product rating=92 初步估计的退火温度在52 左右！
大猫 (2011-10-08 10:24:29)
大猫 (2011-10-08 10:24:53)
错配！
引物二聚体都有3'的（虽然不致命）！
发卡3'
+田田+ (2011-10-08 10:25:32)
错配！
引物二聚体都有3'的（虽然不致命）！
发卡3'
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请问楼上的是不是将anti-sense的方向弄反了啊
04906 (2011-10-08 10:26:00)
浆果儿cc (2011-10-08 10:27:26)
给一对试试：(Sense primer) 5' CCCCTGTTACACCAAGACT 3'
(Anti-sense primer) 5' GGTAGGGAGGGACAGATAA 3'
退火温度在52 左右，扩增412bp。
mRNA检测时，最重要的是Anti-sense primer的选择要合适呀。
采用能行的话，请回过话哪。
猫屎一号 (2011-10-08 10:28:53)
如果是想检测基因表达，可以在上下游分别设计两端片断，分成两管来扩，可以增加严谨性，另外也很容易扩出来的。引物和其他条件应该不是问题，你把问题具体点，我再详细给你解答。
红豆冰 (2011-10-08 10:29:23)
131415 (2011-10-08 10:29:58)
又出去找人设计引物了,还是没有能够设计出一个非常满意的
谢谢hbinx 兄给的引物,我再验证一下
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