[求助]扩增不到所需片段，怎么回事？

最新回复

• koook5695 (2011-10-08 15:18:34)

  能否将你的情况说得再明白些，比如反应体系、循环参数、引物等的情况，这样才好找出症结之所在吗！  

• caihong (2011-10-08 15:19:02)

  楼上朋友：
  我的反应体系用过50ul.25ul
  95度预变性5分钟，然后95度1分钟，55度40S，72度40S，循环2次，再95度40S，55度40S，72度40S，29个循环。
  引物应没有问题，毕竟有带出来。也曾扩增出目的片段，再说用了好几对引物，都是同样的结果。
  请指教！！！！
  谢谢

• 阿拉蕾 (2011-10-08 15:19:20)

  就我认为，设计的２步循环没有什么意义，退火温度没变，反倒缩短了变性时间，不可取！退火温度合适与否尚且不论，单就延伸时间好像也不是很够，而且在最后必须加上５－１０分钟的延伸步骤。

• caihong (2011-10-08 15:19:48)

  我这儿打错了。延伸时间我试过两分半钟和三分钟，前面两个循环，条件较宽，有利于扩增，后面条件严格些，最后我当然用的是72度10分钟。不过看样子你的PCR做的不是很多。我可是做了一年。不过还是非常感谢你。有什么问题及时指点。

• 阿拉蕾 (2011-10-08 15:20:13)

  95度1分钟，55度40S，72度40S，循环2次，
  再95度40S，55度40S，　72度40S，29个循环。
  　
  我倒想请教后面的29个循环与前面的2个循环相比，其＂严格性＂是何以体现的呢？难道不是体现在退火温度？？

• 庄梦蝶 (2011-10-08 15:20:48)

  大家好:
  
  我有一个问题问问各位,我现在要扩增28S-----18S之间的片段,在网上查大约是2KB,但现在的问题是,扩增出来的总是只有1KB,换了好几对引物,差不多都是如此,不过有一次得到所需片段,但没有重复性.各位高手解释一下,看能不能想出什么好的解决办法.
  不胜感激!
  
  ==============================================================================================
  
  首先确定体系没有问题，试一试可以扩出的成熟片段。再就是程序的设置
  1、你的目的片断好像是2k吧？不知道你的复性条件是否合适？最好再摸索几次。
  单从延伸时间就不够一般来说1k大约需要1分钟！所以我建议将延伸时间设为2分钟。试一试？最后的延伸也最好设为10分钟。
  2、酶的活性也比较重要，可以试一下专扩长片段的酶
  3、其他的因素还有很多，模板也可以检查一下，浓度和纯度：）

• caihong (2011-10-08 15:21:47)

  95度1分钟，55度40S，72度40S，循环2次，
  再95度40S，55度40S，　72度40S，29个循环。
  　
  我倒想请教后面的29个循环与前面的2个循环相比，其＂严格性＂是何以体现的呢？难道不是体现在退火温度？？
  
  ==========================================================================================
  
  前面两 个循环一分钟，时间较长，有利于解链和提高产量，但同时会带来非特异性带，后面循环，时间短些。有利于提高特异性。当然还有其它方法 ，书上一般有介绍。
  
  庄梦蝶 朋友：
  首先谢谢你！！
  体系是宝生介绍的，用的也是宝生的酶，只是酶加多了点。用的模板，在做别的PCR时，做出来过，大约是50kb,是用生工的试剂盒提的。 延伸时间三分钟都做不出，两分钟能做出吗？片段是2KB多，所以三分钟不算多吧，最近延伸时间一直是10分钟

• 按秒计算 (2011-10-08 15:22:54)

  按照我的经验
  应该将循环中变性时间，退火时间，延伸时间都家长
  
  还有应该使用扩增长片断的专用酶。

• flower@@ (2011-10-08 15:23:15)

  建议用EX－Taq，同时把延伸时间加长到3分钟，可以把退火温度再降下试试，有产物了再调整。

• caihong (2011-10-08 15:24:05)

  楼上的朋友：
  
  我用的正是EX-taq酶。退火温度不应太低。2KB的退火应改为多么？50S?还是更长？延伸时间三分钟不够长吗？