[求助]偷了我的目的基因？

最新回复

• @花开花落@ (2011-10-08 16:50:41)

  换了NB4细胞株重新做还是这样，今天让我同事做看看结果会怎么样。

• 大虾米 (2011-10-08 16:51:00)

  估计是引物的问题,能否把反应体系写出来看看.  

• 克隆鱼 (2011-10-08 16:51:26)

  换了带酶切位点的上下游引物，PCR循环参数要重新设置啊

• 春雨 (2011-10-08 16:52:04)

  建议做预变性，引物在同一体系做多引物，为防止引物间二聚化，都推荐做预变性。
  还有引物的反复冻融问题要引起重视，用前可以考虑分装。

• 蛐蛐儿 (2011-10-08 16:53:01)

  我的RACE预实验也没成功，关键可能还是因为RT-PCR的问题，现在都不敢做了。
  RT-PCR的试剂盒是TAKARA的mRNA Selective PCR Kit Ver. 1.1。说明可参见
  http://www.takara.com.cn/product/2004/e/e-21fh11001.html
  具体步骤如下
  RT:
  RNA模板预先70度10min变性，立即置于冰上5min。
  加样：
  2*mRNA Selective PCR Buffer2 25UL
  25mM MgCl2 10ul
  10mM dNTP 5ul
  RNase inhabit 1ul
  AMV RTase XL 1ul
  50uM Oligo dT primer 1ul
  RNA模板 6ug
  RNase free water 1ul
  
  总体系50ul，瞬时离心后30度10min，50度30min，5度5min进行反转录。
  
  PCR:
  2*mRNA Selective PCR Buffer2 20UL
  25mM MgCl2 8ul
  10mM dNTP 4ul
  AMV OPTIMIZED Tag酶 1ul
  目的基因上、下游引物 各1ul
  b－actin上、下游引物 各0.5ul
  cDNA 5ul
  灭菌水 9ul
  
  总体系50ul，瞬时离心后85度5min变性，进行35个循环，循环条件:85度45秒，55度45秒，72度90秒。72度延伸7min后结束。

• 嘉年华 (2011-10-08 16:53:32)

  申明一下我现在还在申请版主，还没成功，尚须努力。有几点意见，仅供参考：
  1、我看了你的反应体系，感觉Mg离子的浓度偏大，dNTP量多一点，关系不是太大，但是最适Mg离子浓度需要摸索；
  2、变性通常选择90度以上，我们实验室习惯用94或95度，我不知道你选择85度是不是有特殊要求；
  3、如果你是做半定量的话，两种引物的摩尔数应该是相同的，否则没有可比性。

• 柠檬籽 (2011-10-08 16:53:56)

  1。之所以变性时用85℃是为了减少混入的Genome DNA所致的污染。因为在反转录反应中使用了dNTP analog，降低了合成的cDNA的Tm值，在PCR反应时，由于cDNA可以在较低温度下进行变性（85℃)，所以只有Tm值较低的cDNA可以被扩增； 而Genome DNA由于在低温条件下不能变性，因此不能作为PCR反应的模板被扩增。
  2。“如果你是做半定量的话，两种引物的摩尔数应该是相同的，否则没有可比性”言之有理，之所以不同是因为前面的同事是这么做的，为了保持一致。
  还有你推荐做预变性,我知道了，这就查一下这方面的知识。

• tieshazhang (2011-10-08 16:54:21)

  那你就不要管是否混入Genome DNA，用94℃而非85℃变性作作看。