【求助】请教人外周血淋巴细胞分离，RNA 提取程序！

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• feixi (2016-1-08 11:38:33)

  
  因为细胞内RNA容易降解,所以一般在PBMC提取出来后最好立即进行RNA提取.如果因为标本少,想积攒一批样本后进行提取的话,PBMC的保存应该注意了,不然就会降解的.一般降PBMC放置-80读保存.如果你提取用的是Trizon,此时应将Trizon试剂一起加到PBMC中保存.RNA提出后,应该先測一下OD值,然后再跑一下电泳,这是检验RNA的纯度和完整性,这是保证逆转录成功的前体,不然的话后面就会坐无用功了.

• feixi (2016-1-08 11:38:58)

  其实关于这方面的资料很多。我把我的步骤提供给你参考吧。
  淋巴细胞分离液用的是上海试剂二厂的，效果很好。分离步骤如下：
  1.　在离心管中加入淋巴细胞分离液。
  　　2.　取肝素抗凝静脉血与等量生理盐水充分混匀，用滴管沿管壁缓慢叠加于分层液面上，注意保持清楚的界面。水平离心2000rpm×20分钟。
  　　3.　离心后管内分为三层，上层为血浆和生理盐水，下层主要为红细胞和粒细胞。中层为淋巴细胞分离液，在上、中层界面处有一以单个核细胞为主的白色云雾层狭窄带(如下图)，单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞。此外，还含有血小板。
  　　4.　用毛细血管插到云雾层，吸取单个核细胞。置入另一短中管中，加入５倍以上体积的生理盐水，1500rpm×10分钟，洗涤细胞两次。
  　　5.　末次离心后，弃上清，此时PBMC即可用来提取RNA了。如果此时不想立即提取的话，建议你－80度保存（或同时加入Trizon试剂，或不加）。
  我提取RNA用的是Trizon试剂，操作步骤可参考试剂说明书。

• uuooii (2016-1-08 11:39:13)

  
  我们的做法基本同风飞叶网友的方法，只是PBMC分离稍有不同，我们有PBS而不用生理盐水。收集PBMC洗涤时，第一次离心速度应大一点，可以用2000rpm×10分钟，因为有部分淋巴细胞分离液存在，介质密度较大。

• yysr238 (2016-1-08 11:39:29)

  谢谢两位热情指点，我的外周血不能用肝素抗凝，接下来要提总ＲＮＡ，ＲＴ－ＰＣＲ有什么要注意的吗？
  谢啦！

• 49888 (2016-1-08 11:40:25)

  
  因为细胞内RNA容易降解,所以一般在PBMC提取出来后最好立即进行RNA提取.如果因为标本少,想积攒一批样本后进行提取的话,PBMC的保存应该注意了,不然就会降解的.一般降PBMC放置-80读保存.如果你提取用的是Trizon,此时应将Trizon试剂一起加到PBMC中保存.RNA提出后,应该先測一下OD值,然后再跑一下电泳,这是检验RNA的纯度和完整性,这是保证逆转录成功的前体,不然的话后面就会坐无用功了.

• okhaha (2016-1-08 11:40:43)

  
  "外周血不能用肝素抗凝",可考虑用其他的抗凝剂，如枸橼酸钠等。
  如果标本少,不须积攒也可以进行总RNA提取，另外加点无关细胞就可以啦。

• okhaha (2016-1-08 11:41:31)

  
  另有一点很重要，加入Trizol后，一定要把细胞吹打开，不能一团保存于Trizol中。切记！

• SO2 (2016-1-08 11:42:27)

  
  抽取了上、中层界面处单个核细胞为主的白色云雾层狭窄带后，未进行洗涤，直接-80度保存了半年后，再进行总RNA的提取，结果会受影响吗？提取时需注意什么？谢谢！

• koook5695 (2016-1-08 11:42:41)

  
  估计提出的可能性不大，如果冻的过程中细胞破裂，那RNA被RNA酶消化是在所难免的了，你可以加Trizol后冻起来，一般不会有什么问题的
  我的步骤是这样的：
  1．  外周血及骨髓（抗凝）利用淋巴细胞分离液分离单个核细胞，加入等体积无菌PBS于外周血及骨髓中充分混合，形成细胞悬液；加入另一离心管5ml淋巴细胞分离液。吸取细胞悬液5ml沿管壁轻轻加入到淋巴细胞分离液表面（注意勿与淋巴细胞分离液混合）。离心1000rpm 10min。吸管轻轻吸出白膜中的淋巴细胞入另一离心管中。无菌PBS洗2次（注意离心管壁上黏附的白细胞不要丢弃）。
  2．  以下步骤要严格防止RNA酶降解RNA，所使用的离心管和枪头要用0.1% DEPC水处理24h，然后高压灭菌并烤干。尽量快地进行操作，减少RNA降解。
  3．  利用Trizol的方法提取细胞总RNA（参照Invitrogen公司Trizol说明书），先加1ml Trizol于1×107细胞中，吹打裂解后室温静置5min。加入0.2ml氯仿，颠倒混匀，室温静置2-3min。在4℃下1,2000g离心15min，吸出上清约500μl移入另一离心管，加入500μl异丙醇，颠倒混匀，室温静置10min。4℃ 1,2000g离心10min，倒去上清液，加入1ml 70%乙醇旋转洗涤，4℃ 1,0000g离心5min，去除乙醇后烤干。

• DDD (2016-1-08 11:43:08)

  
  我一般将PBMC放置在液氮中保存，这样会好一些，你可以参考

• finger (2016-1-08 11:43:26)

  你提出RNA后是用什么测OD值?是用紫外分光光度计吗?还是用酶标仪?但我们实验室的酶标仪好象检测不准.跑电泳是用什么电泳呢?多谢指点!

• 66+77 (2016-1-08 11:43:44)

  QUOTE:

  原帖由 finger 于 2016-1-8 11:43 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  你提出RNA后是用什么测OD值?是用紫外分光光度计吗?还是用酶标仪?但我们实验室的酶标仪好象检测不准.跑电泳是用什么电泳呢?多谢指点!

  我测RNA的OD值是用紫外分光光度计，RNA浓度=OD260*40*稀释倍数。
  跑电泳其实普通的琼脂糖凝胶电泳就可以了。

• 00无名指00 (2016-1-08 11:44:01)

  
  请问用于MSP阳性对照的正常人淋巴细胞DNA 的分离和提取用什么办法,具体步骤有哪些?谢谢!

• flyxx05 (2016-1-08 11:44:17)

  请问细胞分离出来后加Trizol保存也是放在-80度保存吗
  还有， 我加了Trizol，氯仿离心后有的标本分三层，但红色在上 ，无色层在下 （Trizol说明书上写的是无色水层在上，底层为红色），这是为什么，我把红色当成水层提RNA了那我提的是什么呀，我想是不是应该测OD值，跑电泳看看
  另外，第二次我把这些加了Trizol，氯仿离心后分层不对头的标本放在4度下放了一天，第二天一看 ，他们又是无色水层在上了 ，底层为红色，
  我是第一次做实验，苦恼中，希望各位高人指点

• cbou876 (2016-1-08 11:44:34)

  把PBMC放在液氮中，是按照细胞冻存的要求做吗：就是要不要加1640（含小牛血清）培养液，还是用PBS洗后就可以直接冻存？要不要按照复苏的要求进行细胞的解冻，复苏后的细胞还要用PBS洗几次？盼回音！感谢！！并愿交流！！

• 911 (2016-1-08 11:44:50)

  
  不好意思，很久没有来这里。我们把PBMC离心收集细胞团，直接提取RNA.如果还要培养就用一般的细胞冻存方法。我没有做过复苏，所以不清楚。我们实验室的细胞冻存和细胞培养书的方法不太一样，复苏是直接用完全培养液边洗涤边移到培养瓶中，这样细胞损伤少一些。不一定要等到冻存液溶解。
  希望对你还有帮助。

• zhenxin (2016-1-08 11:45:09)

  
  请教我提出的淋巴细胞加Trizol后吹打不开，怎么回事？