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[求助]关于RT－PCR
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本人一直在做大鼠心肌中MMP－9的RT－PCR，摸了一个多月的条件就是出不来，最近虽有点收获，循环次数已达到了38次，但条带暗得很，不管怎么努力，条带就是这么暗。而且总有一条非特异性条带，它比目的基因还亮。同一批合成的MMP－2却还不错，做几次就出来了不错的条带。
我的MMP－9是根据外文上所得，其序列为：forward primer:5 AAG GAT GGT CTA CTG GCA C 3, reverse primer:5 AGA GAT TCT CAC TGG GGC 3,扩增长度为280bp,
反应体系：buffer 2.5,Mgcl2 2.0,dNTP 0.5，cDNA 2.0,上下游引物0.4ul (浓度是25pmol/l),Taq酶为1.5单位。加水至25ul体系。
反应条件为：94度5分钟－94度45秒－52度45秒－72度1分钟，38个循环，－72度7分钟。
摸了很多条件，但不管怎样，要么是没条带，要么就是很暗的一条。
当初以为表达量太少了，但cDNA加到2.0都还是不行，从来都没得到过比较亮一点的条带。
我该怎么办，是不是该换引物了，请各位高手多多指教。本人在此不甚感激！
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最新回复
04906 (2011-10-10 10:52:50)
mogu (2011-10-10 10:53:08)
mod=8048 (2011-10-10 10:53:45)
2. 我用软件分析了你的1对引物,它们的Tm值均为55.0度, 另外你要扩增的目的片段仅280bp, 所以帮你修改PCR循环条件为: 94度5分钟, 94度30秒, 55度30秒, 72度30秒，30-35个循环，72度10分钟。请试试.
Good luck to you!
大桃子同学 (2011-10-10 10:54:55)
2. 我用软件分析了你的1对引物,它们的Tm值均为55.0度, 另外你要扩增的目的片段仅280bp, 所以帮你修改PCR循环条件为: 94度5分钟, 94度30秒, 55度30秒, 72度30秒，30-35个循环，72度10分钟。请试试.
Good luck to you!
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RNA 都没问题，有三条带，而且蛮清楚。
请你用软件分析一下我的这对引物好不好。
我用52度都没跑出什么东西来，55度能行吗？另外38个循环都跑过，但条带仍然很暗。
真的很感谢你呀
@花开花落@ (2011-10-10 10:55:32)
请你用软件分析一下我的这对引物好不好。
我用52度都没跑出什么东西来，55度能行吗？另外38个循环都跑过，但条带仍然很暗。
真的很感谢你呀
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1. 我已经用软件分析了你上面写出的引物, 很不错! 引物自身和两引物间均无大的碱基互补、发卡结构等，理论Tm值均为55.0度；
2. 适当提高退火温度是提高特异性扩增的方法之一, 况且你的引物退火温度是55.0度, 为什么要用52度扩增? 如果你实验室有梯度PCR仪, 可设计从50度至60度的退火温度,只用一次PCR 就可搞定最佳退火温度;
3. 条带很暗跟你用的模板量等多因素有关,单靠增加循环数是不能解决问题的, 一般不要超过35循环,过多的循环会增加非特异性条带和扩增的错误率.
大桃子同学 (2011-10-10 10:56:43)
若能用，请问程序怎样设计。
我真还弄不懂为什么“只用一次PCR 就可搞定最佳退火温度”
请指教，谢谢
大桃子同学 (2011-10-10 10:57:40)
2. 适当提高退火温度是提高特异性扩增的方法之一, 况且你的引物退火温度是55.0度, 为什么要用52度扩增? 如果你实验室有梯度PCR仪, 可设计从50度至60度的退火温度,只用一次PCR 就可搞定最佳退火温度;
3. 条带很暗跟你用的模板量等多因素有关,单靠增加循环数是不能解决问题的, 一般不要超过35循环,过多的循环会增加非特异性条带和扩增的错误率.
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我那倒有一台PTC-200 PCR仪，不知能否做梯度PCR用。
若能用，请问程序怎样设计。
我真还弄不懂为什么“只用一次PCR 就可搞定最佳退火温度”
请指教，谢谢
大桃子同学 (2011-10-10 10:58:38)
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你也在做相同的东西吗，
怎样联系你呢
大桃子同学 (2011-10-10 10:59:26)
2. 适当提高退火温度是提高特异性扩增的方法之一, 况且你的引物退火温度是55.0度, 为什么要用52度扩增? 如果你实验室有梯度PCR仪, 可设计从50度至60度的退火温度,只用一次PCR 就可搞定最佳退火温度;
3. 条带很暗跟你用的模板量等多因素有关,单靠增加循环数是不能解决问题的, 一般不要超过35循环,过多的循环会增加非特异性条带和扩增的错误率.
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再请教您一个问题：
我欲做SD大鼠TIMP-2的RT-PCR。
其引物是外文上所得，但文章上没给出反应的条件。
请各位高手分析一下此引物的优劣，对此引物PCR，您能给出一些建议吗？
rat TIMP-2:
forward primer: 5' ATT TAT CTA CAC GGC CCC 3'(469-486),
reverse primer: 5' CAA GAA CCA TCA CTT CTC TTG 3'(810-790)
荷塘青蛙！ (2011-10-10 10:59:54)
从你前面的帖子情况看来，有以下几种可能性：
1、引物合成的不纯，国内现在的厂家合成的引物有时为了降低成本，纯度不够，会影响结果；所以你同一批合成的引物，有的好用，有的不好用，这都是大家碰到的实际情况；甚至这一次好用，下一次不好用，也是很常见的；
2、引物如果不太纯，可以用提高酶质量的方法，来获得相对满意的结果。
如采用热启动的酶，酶效较高，且酶有了化学修饰，常温下不起反应，非特异性条带少，可以相对改进目前的结果；
酶不好，扩增的非特异性条带会比较强，即使目的基因有扩增，条带暗且可能比较宽。不知你用的是谁家的酶？酶的后期纯化工艺很重要，有的反应体系特别挑酶。
我们曾经做过一个反应体系，极其挑剔，引物的纯度要用HPLC来检，引物的量也要极其准确；酶更挑剔，连罗氏、PE的酶在体系里都不行，后来终于找到了一两家可以的，且不是次次都好，主要是酶的后期纯化，里面的杂质对反应体系有干扰。
3、还有反应体系的优化。优化的比较好的体系，对酶、对引物的挑剔性也会少一点。另外优化反应体系也是个功夫活，我建议你改用50微升体系，体系大一点，重复性会好一些；
按理你的引物应不错，优化体系是个经验和时间问题。会苦尽甘来的！
总之，反应的影响因素太多，我建议你先换酶试试看，因为这样的成本比较低！另我手头上有一种通用的PCR核心试剂混合物，包含了经过优化的缓冲液、dNTP、Taq DNA 聚合酶混合物和MgCl2溶液，成为一个即时可用的混合物， 你只需用氯化镁来优化镁离子浓度，这可缩短你优化体系的时间。你也可以试试看！
祝你好运！
大桃子同学 (2011-10-10 11:01:25)
从你前面的帖子情况看来，有以下几种可能性：
1、引物合成的不纯，国内现在的厂家合成的引物有时为了降低成本，纯度不够，会影响结果；所以你同一批合成的引物，有的好用，有的不好用，这都是大家碰到的实际情况；甚至这一次好用，下一次不好用，也是很常见的；
2、引物如果不太纯，可以用提高酶质量的方法，来获得相对满意的结果。
如采用热启动的酶，酶效较高，且酶有了化学修饰，常温下不起反应，非特异性条带少，可以相对改进目前的结果；
酶不好，扩增的非特异性条带会比较强，即使目的基因有扩增，条带暗且可能比较宽。不知你用的是谁家的酶？酶的后期纯化工艺很重要，有的反应体系特别挑酶。
我们曾经做过一个反应体系，极其挑剔，引物的纯度要用HPLC来检，引物的量也要极其准确；酶更挑剔，连罗氏、PE的酶在体系里都不行，后来终于找到了一两家可以的，且不是次次都好，主要是酶的后期纯化，里面的杂质对反应体系有干扰。
3、还有反应体系的优化。优化的比较好的体系，对酶、对引物的挑剔性也会少一点。另外优化反应体系也是个功夫活，我建议你改用50微升体系，体系大一点，重复性会好一些；
按理你的引物应不错，优化体系是个经验和时间问题。会苦尽甘来的！
总之，反应的影响因素太多，我建议你先换酶试试看，因为这样的成本比较低！另我手头上有一种通用的PCR核心试剂混合物，包含了经过优化的缓冲液、dNTP、Taq DNA 聚合酶混合物和MgCl2溶液，成为一个即时可用的混合物， 你只需用氯化镁来优化镁离子浓度，这可缩短你优化体系的时间。你也可以试试看！
祝你好运！
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谢谢您的指点，我已决定换换MMP－9的引物试试看。
bring (2011-10-10 11:02:13)
O2:5’TATTGCGGCCGCGTCCCGGTGCTCAGCT3’（下游）我扩增的片断长度为1.5kb，用的是promega access RT-PCR试剂盒.
bring (2011-10-10 11:03:21)
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