[求助]单一DNA条带回收后扩增为什么出多条带？

最新回复

• 阿拉蕾 (2011-10-11 11:43:09)

  我想说明的如下：
  1、这种情况是有的，给我的第一感觉是，你的引物是否有错配的情况，这是出现多条带的常见原因；
  2、其次，非特异性反应不仅与模板相关，而且和退火温度也密切相关，我们在摸条件的时候经常出现这样的情况，在不断提高退火温度的时候，非特异性条带在逐渐减少；
  3、我看到你最后的回收产物是溶于TE中的，由于TE中的EDTA可与反应体系中的Mg离子鳌合，从而影响你的结果。

• BUK (2011-10-11 11:43:38)

  谢谢！
  
  我是从cDNA中调目的基因，有错配，但不多
  
  退火温度60，还能再升高吗？
  
  回收产物溶于ddH2O有什么缺点呢？

• 阿拉蕾 (2011-10-11 11:44:10)

  退火温度60，还能再升高吗？
  
  回收产物溶于ddH2O有什么缺点呢？
  
  =========================================
  
  如果杂带多的话，还可以提；
  如果做二次的话，回收产物溶于TE buffer的话，有缺陷。

• BUK (2011-10-11 11:44:43)

  谢谢！
  
  你能帮我分析一下引物吗？非常感谢
  
  一共四对引物
  上游引物1：5'ATGATGGATCAAGCTAGATC3'
  下游引物1：5'ACCTGAATCTTAACAAAATG3'
  上游引物2：5'CATTTTGTTAAGATTCAGGT3'
  下游引物2：5'AGAATTTTTATCTCTTTCAG3'
  上游引物3：5'CTGAAAGAGATAAAAATTCT3'
  下游引物3：5'ACTTTGCTGGCCCAGTTGCT3'
  上游引物4：5'AGCAACTGGGCCAGCAAAGT3'
  下游引物4：5’TTAAAACTCATTGTCAATGT3’
  
  基因：ggcggctcgggacggaggacgcgctagtgtgagtgcgggcttctagaactacaccgaccctcgtgtcctcccttcatcct
  gcggggctggctggagcggccgctccggtgctgtccagcagccatagggagccgcacggggagcgggaaagcggtcgcgg
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  cggtagacttgtttacctggtggagaatcctgggggttatgtggcgtatagtaaggctgcaacagttactggtaaactgg
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• BUK (2011-10-11 11:45:09)

  ctctccctacgtatctccaaaagagtctcctttccgacatgtcttctggggctccggctctcacacgctgccagctttac
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  tggactattcagggagctgcaaatgccctctctggtgacgtttgggacattgacaatgagttttaaatgtgatacccata
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  tcgggaacagtgtttcccataattttcttcatgcaatgacatcttcaaagcttgaagatcgttagtatctaacatgtatc
  ccaactcctataattccctatcttttagttttagttgcagaaacattttgtggtcattaagcattgggtgggtaaattca
  accactgtaaaatgaaattactacaaaatttgaaatttagcttgggtttttgttacctttatggtttctccaggtcctct
  acttaatgagatagcagcatacatttataatgtttgctattgacaagtcattttaatttatcacattatttgcatgttac
  ctcctataaacttagtgcggacaagttttaatccagaattgaccttttgacttaaagcagagggactttgtatagaaggt
  ttgggggctgtggggaaggagagtcccctgaaggtctgacacgtctgcctacccattcgtggtgatcaattaaatgtagg
  tatgaataagttcgaagctccgtgagtgaaccatcatataaacgtgtagtacagctgtttgtcatagggcagttggaaac
  ggcctcctagggaaaagttcatagggtctcttcaggttcttagtgtcacttacctagatttacagcctcacttgaatgtg
  tcactactcacagtctctttaatcttcagttttatctttaatctcctcttttatcttggactgacatttagcgtagctaa
  gtgaaaaggtcatagctgagattcctggttcgggtgttacgcacacgtacttaaatgaaagcatgtggcatgttcatcgt
  ataacacaatatgaatacagggcatgcattttgcagcagtgagtctcttcagaaaacccttttctacagttagggttgag
  ttacttcctatcaagccagtacgtgctaacaggctcaatattcctgaatgaaatatcagactagtgacaagctcctggtc
  ttgagatgtcttctcgttaaggagtagggccttttggaggtaaaggtata

• 阿拉蕾 (2011-10-11 11:46:01)

  你能帮我分析一下引物吗？非常感谢
  
  一共四对引物
  上游引物1：5'ATGATGGATCAAGCTAGATC3'
  下游引物1：5'ACCTGAATCTTAACAAAATG3'
  
  ======================================================
  
  有发夹结构，错配及自身二聚体，其中错配在693-700bp △G分别为-1.3 、
  13.3 和-5.6

• 阿拉蕾 (2011-10-11 11:46:21)

  上游引物2：5'CATTTTGTTAAGATTCAGGT3'
  下游引物2：5'AGAATTTTTATCTCTTTCAG3'
  
  ==========================================
  
  有二聚体和错配，其中错配在4124-4131bp ，△G分别为
  -4.9和-12.6

• 阿拉蕾 (2011-10-11 11:46:54)

  上游引物3：5'CTGAAAGAGATAAAAATTCT3'
  下游引物3：5'ACTTTGCTGGCCCAGTTGCT3'
  
  ==========================================================
  
  有发夹结构，错配及自身二聚体，其中错配在3290-3298bp △G分别为-0.1 、
  - 13.8和-6.4

• 阿拉蕾 (2011-10-11 11:47:21)

  上游引物4：5'AGCAACTGGGCCAGCAAAGT3'
  下游引物4：5’TTAAAACTCATTGTCAATGT3’
  
  =========================================================================================================
  
  有发夹结构，错配及自身二聚体，其中错配在797-805bp △G分别为-0.4 、
  -16.5 和-9.3
  
  以上我是用primer premier 5.0分析sense pimer 得到的结果，我不是很清楚您后续实验，没有贸然给您设计引物，如果需要的话，请回话！

• BUK (2011-10-11 11:47:59)

  我是从培养细胞中通过RT－PCR调基因（约2.3kb），然后表达。做了两个月也没做出来，就把这个基因分成四段，就是你分析的这四对引物，这四个片段从cDNA中都调出来过，都是单一条带，但回收后再扩增，只有第二个片段是单一条带，其他三个都是很多小的杂带。我想把这四段都测序，然后连起来，现在只有第二个能测了：(

• 饭团团 (2011-10-11 11:48:34)

  这些引物错配和二聚体对PCR的影响很大吗？
  
  PCR的模板都是纯化后的单一条带的DNA啊

• BUK (2011-10-11 11:49:05)

  如果重新设计引物，我还要从cDNA中调基因，就很难了！
  如果你觉得我的引物问题很严重，就帮我设计一下吧
  
  谢谢：）

• 阿拉蕾 (2011-10-11 11:49:30)

  引物错配会使你扩出多条带，发夹结构和二聚化会降低扩增效率。如果你合成了引物的话，可以试试，如做hot stat ，touchdown ，多摸摸条件，有条带出现，不单一的话，可以做切胶回收。

• BUK (2011-10-11 11:49:59)

  我的多条带距离很近，根本分不开，而且都是100－300bp的小片段，没有大小正确的  

• BUK (2011-10-11 11:50:29)

  请你帮我设计一对引物吧
  在上游引物1和下游引物4之外就行
  占用您这么多时间，真是不好意思